قاسم حسینی سالکده
غلامرضا صالحی جوزانی

یکی از مهم ترین روش های نگهداری علوفه، تهیه سیلاژ می باشد که در آن میزان اسیدیته علوفه سیلو شده (برای مثال ذرت) طی فرایند تخمیر بی هوازی به سرعت کاهش می یابد و در نتیجه امکان فساد و رشد عوامل بیماری زا به حداقل می رسد. یکی از مکمل های بیولوژیک و مهم مورد استفاده در افزایش کیفیت و ماندگاری سیلاژ علوفه های مختلف، فرمولاسیون های باکتریایی است که در فرایند سیلاژ و تخمیر نقش دارند. شناسایی تاکسونومیک میکروبیوم دخیل در فرایند تخمیر سیلاز کمک مهمی در راستای شناسایی گونه های میکروبی است که در فرایند تخمیر دخیل هستند. در پروژه حاضر که پروژه دوم طرح تحقیقاتی با عنوان "جداسازی و شناسایی سوش های مناسب میکروبی در تخمیر طبیعی سیلاژ ذرت" می باشد،از روش های مبتنی بر توالی یابی نسل جدید برای شناسایی میکروبیوم دخیل در فرایند تخمیر سیلاژ در سیلاژهای ذرت نمونه برداری شده از سه منطقه جغرافیایی مختلف (گرکان، قزوین و اصفهان) در بازه های زمانی مختلف پس از سیلاژ (0، 3، 6، 14، 21، 32، 90 و 365 روز) استفاده شد. بدین منظور، ابتدا از مزارع ذرت از سه منطقه متفاوت آب وهوایی کشور شامل اصفهان ،گرگان و قزوین، ذرت علوفه ای برداشت شده و در همان محل توسط دستگاه چاپر خرد شده و در قالب طرح آماری در مینی سیلوهای آزمایشگاهی در محل پژوهشکده سیلو شدند. در بازه-های زمانی مختلف از سیلوها نمونه برداری انجام گرفت. پس از جداسازی میکروب های متصل به بافت های علوفه سیلاژ شده،DNAیژنومی میکروبیوم نمونه ها استخراج شد. برای تکثیر توالی ژن 16SrRNA سویه های مختلف باکتریایی، از پرایمرهایعمومی بارکد شده که نواحی متغیرV1-V3ژن 16SrRNA را تکثیر می کنند،استفاده شد. پس از تکثیر،محصولاتPCRخالص سازی و به نسبت مساوی مخلوط شده و به وسیله سیستم 454 pyrosequencing توالی یابی شدند. در نتیجه توالی یابی در مجموع 264000 توالی اولیه با میانگین طولی 266 باز بدست آمد. پس از حذف توالی های با طول بیشتر از 1000 و کمتر از 200، توالی های با تعدادباز مبهم بیشتر از 6، توالی های با هموپلیمر با طولبیشتر از 6 و توالی های با تعداد mismatch بیشتر از 2 در پرایمر،در مجموع 103000 توالی با کیفیت برای آنالیزهای پایین دست باقی ماند. بررسی توالی های باقی مانده منجر به شناسایی حدود3700 واحد تاکسونومی OTUشد. در سطح شاخه (phylum)بیش از 83 درصد از توالی ها به شاخه Firmicutes، 3 درصد به شاخه Proteobacteriaو 01/0 درصد به شاخه Bacteroidetes نسبت داده شدند و بقیه یا به طور محدود به شاخه های Actinobacteria و Cynobacteria نسبت داده شدند و یا به شاخه خاصی نسبت داده نشدند. نتایج نشان داد که با گذر زمان جمعیت باکتری های خانواده Leuconostocaceae که در ابتدا در نمونه های اولیه قبل از سیلاژ زیاد بوده و به تدریج در بازه زمانی نمونه برداری و فرایند تخمیر سیلاژ کاهش می یابد. از طرفی جمعیت باکتری های خانواده Lactobacillaceaeکه نقش بسیار مهمی در انجام فرایند تخمیر اسید لاکتیکی سیلاژ ایفا می کنند،در ابتدا اندک بوده اما سه روز پس از شروع فرایند سیلاژ جمعیت آنها به شدت افزایش یافته و تا انتهای دوره سیلاژ جمعیت غالب میکروبیوم سیلاژ را تشکیل می دهند. کلمات کلیدی:متاژنومیکس، میکروبیوم، سیلاژ، ذرت،454 pyrosequencing