جلیل ذریه زهرا
مریم قیاسی
سمیه حقیقی
عیسی شریف پور
علی قرشی
اسماعیل صابرفر
مصطفی شریف روحانی
جمال نجفی
پروانه صیفوری
شهریار بهروزی
فرامرز لالویی
علیرضا شناورماسوله
جلیل معصوم زاده
محمد مهدیزاده
محمدرضا میرهاشمی نسب
کامران اصغرنیا
ریحانه صالحی تبار
شاپور کاکولکی
سهیل بازاری مقدم
علی حلاجیان
مهدی علیزاده
جلیل جلیل پور
فریدون چکمه دوز
حسن نظام آبادی
منیژه فقید
علی اصغر سعیدی
محمد بینایی
محبوبه نیرانی
آذین زاهدی
علیرضا نظری
بهراز مخبرملکی
بابک رمضانی
رضا نهرور
جواد دقیق روحی
عباس نوری
غلامرضا درویشی
عباس بری
فیروزه فرح تاج
مهدی سلطانی
محدث قاسمی

این مطالعه به منظور جداسازی و شناسایی نوداویروس عامل بیماری نکروز عصبی ویروسی‭( VNN ) ‬از ماهیان کفال طلایی‭(liza auratus) ‬دریای خزر صید شده در صیدگاههای استانهای حاشیه جنوب دریای خزر شامل گیلان، مازندران و گلستان و با کمک روشهای کشت سلولی، واکنش زنجیره ای پلیمراز دو مرحله ای ‭(Nested-RT-PCR) ‬، آزمایش پادتن های درخشان‭) (IFAT ‬، ایمونوهیستوشیمی ‭(IHC) ‬، هیستوپاتولوژی، هماتولوژی، باکتریولوژی و میکروسکوپ الکترونی انجام شد. پس از دریافت گزارشهای متعدد مبنی بر بروز تلفات و مشاهده علایم بالینی شامل شنای نامتعارف ( مارپیچی، چرخشی، خوابیده به پشت در سطح آب ) و اتساع محوطه شکمی در ماهیان کفال طلایی صید شده در صیدگاههای سه استان مذکور ضمن مراجعات مکرر به پره های صیادی در طول فصول صید سالهای ‮‭1385‬ تا ‮‭1388‬ تعداد ‮‭428‬ ماهی کفال طلایی در محدوده وزنی ‮‭50‬ تا ‮‭250‬ گرم نمونه برداری گردیدندکه تعدادی در حدود ‮‭312‬ ماهی کفال در استان گیلان و ‮‭116‬ عدد نیز از استانهای گلستان و مازندران صید شدند که اغلب آنها دارای علایم بالینی همچون شنای نامتعادل، تیرگی رنگ بدن و اتساع محوطه شکمی بودند. بافتهای مغز و چشم از ماهیان مورد مطالعه در شرایط استریل جداسازی و جهت انجام آزمایشات کشت سلولی و ‭Nested-RT-PCR ‬در فریزر ‮‭80‬ ‭C ‬نگهداری شدند. به طور همزمان قطعاتی از بافتهای مذکور در فرمالین ‮‭10‬ درصد جهت انجام آزمایشات هیستوپاتولوژی و ایمونوهیستوشیمی و قطعه ای در گلوتارآلدهید 3 درصد برای آزمایش میکروسکوپ الکترونی تثبیت گردیدند.شش روز بعد از تلقیح هموژن فیلتر شده بافتهای مغز و چشم بر روی تک لایه سلولی 1‭-SSN ‬، آثار آسیب سلولی ‭( CPE ) ‬به صورت واکویولاسیون مشاهده شد که در پاساژهای دوم و سوم نیز با شدت بیشتری ایجاد گردید. در مجموع تلقیح هموژن 9 نمونه از ‮‭312‬ ماهی باعث ایجاد ‭CPE ‬گردید. انجام آزمایش ‭Nested- RT-PCR ‬بر روی نمونه های بافتی و سلول های 1‭-SSN ‬آلوده شده‭( CPE ‬مثبت) نتایج مشابهی را به همراه داشت. در آزمایش مستقیم نمونه های بافتی تعداد ‮‭21‬ نمونه مثبت بود وهمچنین تمام نمونه های حاصل از سلولهای 1‭-SSN ‬آلوده‭( CPE ‬مثبت) در آزمایش مزبور مثبت تشخیص داده شدند. در ادامه تشخیص نوع ویروس، آزمایش پادتن های درخشان با استفاده از دو نوع آنتی بادی مونوکلونال مختلف برروی مقاطع بافتی مغز و چشم ماهیان کفال دارای علایم و سلول های آلوده شده 1‭-SSN ‬انجام شدکه ایجاد نقاط درخشان حاکی از وجود آنتی ژن نودا ویروس در نمونه های مورد آزمایش بود و نتایج کشت سلول و ‭Nested- RT- PCR ‬را تایید نمود. در آزمایشات آسیب شناسی بافتی، واکویولاسیون در مقاطع مغز و شبکیه چشم، نخاع و عصب بینایی در اکثر نمونه ها مشاهده گردید و با استفاده از آنتی بادی مونوکلونال ضد نودا ویروس و رنگ آمیزی ‭DAB ‬بر روی مقاطع بافتی در آزمایش ایمونوهیستوشیمی، حضور آنتی ژن های نودا ویروس به صورت نقاط قرمز- قهوه ای مشخص گردید. در آزمایش میکروسکوپ الکترونی با توجه به پراکندگی ویروس در نمونه های بافتی، مقاطع ویروس به صورت دوایری با قطر حدود ‮‭30‬ ‭nm ‬و دارای آرایش منظم تنها در یک نمونه از مقطع چشم ماهی کفال طلایی مشاهده گردید. به منظور تعیین بیماریزایی ویروس جداشده و بررسی امکان انتقال آن از ماهی کفال طلایی به گونه های دیگر، سوپرناتانت سلول 1‭-SSN ‬دارای ‭CPE ‬با ماهیان گوپی ( به صورت حمام) و بچه ماهیان قره برون ( به صورت تزریق در پشت حدقه چشم) مواجهه داده شد که در هر دو مورد علاوه بر بروز علایم بالینی، واکویولاسیون شدید در مغز و شبکیه چشم آنها نیزمشاهده شد. در ادامه مطالعات بیماریزایی، نمونه های ماهی گوپی دارای علایم بالینی با میکروسکوپ الکترونی و آزمایش ایمونوهیستوشیمی مورد بررسی قرار گرفتند و نتایج حاصله نشان داد که حضور نودا ویروس با بروز علایم بالینی، کالبد گشایی و تلفات در ارتباط بوده و می توان بتا نودا ویروس را به عنوان عامل اصلی تلفات ناشی از بروز بیماری نوپدید نکروز عصبی ویروسی ‭(VNN) ‬درکفال ماهیان دریای خزر محسوب نمود. واژه کلیدی: ایران ، دریای خزر، بیماری نکروز عصبی ویروسی، کفال طلایی، تیره سلولی 1‭-SSN ‬، آزمایش پادتن های درخشان، ایمونوهیستوشیمی، ‭Nested-RT-PCR