عباسعلی یداللهی - استادیار، عضو هیات علمی گروه مهندسی کشاورزی، دانشگاه پیام نور
غزل قجری - دانش آموخته کارشناسی ارشد، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران

هدف: اطلاعات کمی در مورد متابولیسم قند و نحوه ادغام آن با سایر مواد، در مقایسه با سایر محصولات فتوسنتزی اولیه (مانند ساکارز و نشاسته) وجود دارد. Mannose-۶-phosphate reductase (M۶PR) یک آنزیم کلیدی است که در بیوسنتز مانیتول در کرفس نقش دارد. هدف از این پژوهش  همسانه سازی ژن، بررسی بیان ژن و تخلیص آنزیمM۶PR  و بررسی عملکرد آن بر روی ژن­های جهش یافته در محیط آزمایشگاهی بوده است. مواد و روش ها: ابتدا  استخراج mRNA از گیاه کرفس انجام شدو سپس سنتز cDNA صورت گرفت و محصول به عنوان الگو در تکثیر ژن M۶PR  مورد استفاده قرار گرفت..محصول PCR توسط کیت استخراج DNA از روی ژل، تخلیص شد. محصول PCR خالص شده مطابق با دستور العمل T/A Cloning (فرمنتاز) در ناقل pTZ۵۷R همسانه سازی شد. سلول مستعد E.coli سویه Top۱۰ با استفاده از روش بیوشیمیایی کلرید کلسیم تهیه شد و وکتور نوترکیب درون آن ترانسفورم و روی پلیت حاوی آمپی سیلین کشت داده شدند. صحت کلونینگ با استفاده از PCR ژن­M۶PR  و هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب توسط آنزیم های BamHI, SacI (شرکت فرمنتاز) انجام گرفت.  سپسژن M۶PR  در پلاسمید بیانی pET۳۲a  همسانه سازی شد و درون باکتری E.coli سویه BL۲I انتقال داده شد. پیشبر ژن با IPTG القا شد و با وسترن بلاتینگ مورد بررسی قرار گرفت.  پروتئین تولید شده با ستون کروماتوگرافی تمایلی (His.Tag/S.Tag) تخلیص شد. نتایج: نتایج نشان دادند که آنزیم می­تواند نواحی هترودوبلکس ژن را شناسایی کند.­M۶PR  نوترکیب خالص­شده از اشریشیا کلی،دارای فعالیت خاص مولکولی بود. نتایج حاصل از هضم دوگانه پلاسمید با آنزیم­های SacI و BamHI، قطعات ۲۸۷۰ جفت بازی و ۱۸۶ جفت بازی بود. قطعه حاضر مطابق با نتیجه ازمون بلاست شباهت ۱۰۰درصدی با ژن M۶PR گیاه کرفس داشت. نتایج بررسی رونویسی ژن نوترکیب M۶PR نشان داد که میزان رونویسی ژن نوترکیب M۶PR در سویه­های تراریخت برابر با ۳/۲ و در کنترل ۳۲/۰ به دست آمد که تفاوت معناداری در سطح P<۰.۰۱ را از نظر آماری نشان دادند. پس از القای پیشبر و نمونه برداری در زمان­های مختلف، نمونه­ها روی ژل SDS-PAGE باند پروتئینی در ناحیه ۴۲ کیلو دالتون را نشان داد که نشان دهنده بیان پروتئین به صورت موفقیت آمیز بود. نتیجه گیری:  همسانه سازی ژن آنزیمM۶PR  بدست آمده از گیاه کرفس و به دنبال آن تولید این آنزیم به صورت نوترکیب در آزمایشگاه می تواند منجر به بیان بالای  آن در سیستم پروکاریوتی  شود به طوریکه آنزیم دارای فعالیت  باشد. همچنین مطالعه حاضر نشان داد که آنزیم­های گیاهی وقتی در باکتری بیان می­شوند، فعال می­باشند و می­توانند به عنوان منبع مناسب برای تسریع فعالیت کاتابولیک استفاده شوند.

آنزیم M۶PR, وسترن بلاتینگ, پلاسمید pET۳۲a, پروتئین نوترکیب, کروماتوگرافی تمایلی