امین عابدی - دانشجوی دکترای بیوتکنولوژی کشاورزی- گیاهی، دانشکده کشاورزی دانشگاه گیلان
محمد مهدی سوهانی - استادیار گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه گیلان
سیدحسن حسنی - استادیار گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه گیلان

آنزیم 5- انول پیروویل شیکیمات 3- فسفات سینتاز ( EPSPS ) مرحله ششم مسیر شیکیمات را که برای سنتز اسیدهای آمینه و ترکیبات حلقوی در جلبک ها، قارچ ها، باکتری ها و گیاهان پیشرفته ضروری است کاتالیز می کند. این آنزیم محل اثر علف کش گلایفوسیت می باشد که عمل بازدارندگی خود را از طریق رقابت با فسفو انول پیرووات( PEP ) در محل اتصال آن با این آنزیم اعمال می کند. اسیدهای آمینه متفاوتی در این آنزیم تغییر داده شده اند که هر کدام سطوح مقاومت متفاوتی را نسبت به گلایفوسیت نشان داده اند. یکی از اسیدهای آمینه ای که مورد مطالعه قرار گرفته اند گلایسین 96 می باشد که در جایگاه اتصال PEP به آنزیم قرار دارد. در این مطالعه برای جایگزینی Gly96 با اسیدآمینه های آلانین (A) و والین(V) با استفاده از DNA ژنومی باکتری E.coli K12 ژن AroA مربوط به این آنزیم را با واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) با پرایمرهای اختصاصی دارای جایگاه برش Xba1 و Sma1 تکثیر و در وکتور کلونینگpTZ57R/T همسانه سازی شد. برای ایجاد جهش های مورد نظر در ژن EPSPS از روش جهش زایی هدایت شده استفاده گردید. دراین روش ابتدا با استفاده از پرایمر موتانت و یکی از پرایمرهای اختصاصی ژن(P1) مگا پرایمر ایجاد و در مرحله بعد از مگاپرایمر به عنوان پرایمراختصاصی ژن استفاده و همراه با پرایمر اختصاصی دوم(P2) ، ژن جهش یافته با طول کامل تکثیر شد. ژن های جهش یافته در داخل وکتور pTZ5R/T همسانه سازی شد. ژن های تیپ وحشی و جهش یافته پس از توالی یابی برای تراریزش گیاه برنج در پلاسمید بیانی pPZPY122 همسانه سازی گردید.

گلایفوسیت، مگاپرایمر، آنزیم EPSPS synthase ، ژن AroA