جداسازی و شناسایی عامل (عوامل) پنومونی پاستورلایی در گوساله ها (استان های تهران و البرز)

پنومونی پاستورلایی، بیماری رایج و با اهمیت اقتصادی فراوان در گوساله هاست که به طور معمول در گوساله های یک تا پنج ماه و اغلب در فصول پاییز و زمستان مشاهده می شود. بدون شک انتخاب واکسن مناسب برای جلوگیری و یا به حداقل رساندن زیان ناشی از پنومونی پاستورلایی منوط به شناسایی دقیق عامل یا عوامل ایجاد کننده بیماری است. به جهت کنترل بیماری مذکور در ایران، موسسه رازی از سال 1338 تاکنون اقدام به تولید واکسن پاستورلوز گاوی با استفاده از سروتیپ B2 نموده است. وجود برخی ابهامات در مورد کارآیی واکسن مزبور در جمعیت گوساله ها، در بعضی از گاوداری های دو استان تهران و البرز، تصور حضور سروتیپ های جدید را ایجاد نمود. این تحقیق با هدف تعیین بیوتیپ(های) عامل پنومونی پاستورلایی در گوساله ها با استفاده از آزمون های میکروب شناسی، بیوشیمیایی و مولکولی به منظور تهیه سوش(های) لازم برای انجام بررسی های بعدی مرتبط با واکسن پاستورلوز گوساله ها انجام شد. در این پروژه پس از انجام هماهنگی های لازم با ادارات کل دامپزشکی استان های تهران و البرز، به کشتارگاه های صنعتی دو استان مذکور، مراجعه و از گوساله های واجد علایم پنومونی، در سالن انتظار، نمونه سوآب بینی و در سالن کشتار، از ریه های دارای علایم، نمونه میکروبی تهیه شد. در مجموع 681 نمونه تحت آزمایش قرار گرفتند.نمونه های سوآب دریافتی در modified stuart's transport medium و نمونه های بافتی در brain heart infusion broth و در کنار یخ به آزمایشگاه منتقل شدند. در آزمایشگاه در شرایط استریل، نمونه های سوآب و بافتی دریافت شده برای انجام آزمایشات میکروبی, در Blood agar کشت و سپس با توجه به تنوع باکتری های رشد یافته روی محیط، با مداقه بر اندازه، رنگ و شکل کلنی های پاستورلا، کشت مجدد روی Blood agar و خالص سازی انجام شد.در صورتی که نتیجه رشد در محیط مذکور، بررسی های ظاهرشناسی و نیز نتیجه بررسی میکروسکوپی گسترش های رنگ آمیزی شده با رنگ گرم، مثبت بود، رشد در محیط مایع Brain heart broth بررسی شد. در مواردی که کشت در محیط مایع نیز موفقیت آمیز بود، آزمون های Catalase و Oxidase و در شرایطی که نمونه همولیز مثبت بود، کشت بر روی McConkey agar انجام شد. در صورت تطبیق نتایج آزمایشات پیش گفته با استاندارد پاستورلا، آزمون حساسیت به پنی سیلین انجام شد. در صورت تایید حساسیت جدایه نسبت به پنی سیلین و با هدف حصول اطمینان از پاستورلا بودن آن، باکتری در محیط های تفریقی Kligler agar جهت بررسی تخمیر قندهای گلوکز و لاکتوز, ایجاد گاز وS 2H، Ornithin decarboxilase broth, Urease, MR-VP broth و SIM medium برای بررسی تحرک باکتری و نیز آزمون Indol, کشت شد. در مجموع طی 36 بار مراجعه به کشتارگاه های صنعتی دو استان تهران و البرز، 681 نمونه دریافت و تحت آزمایش قرار گرفتند. 421 نمونه متعلق به استان تهران و 260 نمونه متعلق به استان البرز بود. از نظر نوع، 595 نمونه سوآب بینی و 86 نمونه، بافت ریه بود. ماحصل کشت، جداسازی و انجام آزمایشات بیوشیمیایی، 89 جدایه بود. 89 جدایه بدست آمده از کشت، جداسازی و انجام آزمایشات بیوشیمیایی، پاستورلا مولتوسیدا تشخیص داده شدند.در مرحله بعدی جدایه ها تحت واکنش زنجیره ای پلی مراز(PCR) قرار گرفتند. برای تشخیص پاستورلا مولتوسیدا از پرایمر (KMT1)PM و برای تشخیص تیپ کپسولی نمونه ها از 3 جفت پرایمر capA، capB و capD استفاده شد. 64 نمونه از جدایه های فوق به عنوان پاستورلا مولتوسیدا تایید شدند. از این تعداد، 60 جدایه دارای تیپ کپسولی A، 1 جدایه دارای تیپ کپسولی B و تیپ کپسولی 3 جدایه Untypable بود. هیچکدام از جدایه ها دارای تیپ کپسولی D نبودند. از هر ژن، یک نمونه محصول PCR جهت تعیین توالی به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال شد. توالی های به دست آمده با استفاده از نرم افزارهای Chromas lite و BLAST مورد ارزیابی و تایید قرار گرفتند. با هدف نگهداری طولانی مدت جدایه ها, محیط گلیسیرین تهیه و جدایه ها در آن نگهداری شدند.کلمات کلیدی :پاستورلوز، پنومونی پاستورلایی، گوساله، جداسازی، شناسایی