مهندسی ژنتیک لیموترش با استفاده از آنتیبادیهای نوترکیب برای مقاومت به بیماری جاروک لیموترش

چکیده بیماری جاروک‭) Witches Broom disease of lime (WBDL ‬مهمترین بیماری لیموترش در استان های جنوبی کشور می باشد. این بیماری در طی دو دهه اخیر باعث انهدام گسترده باغات لیمو در این مناطق گردیده است. بیماری توسط ‭Candidatus Phytoplasma aurantifolia ‬ایجاد می گردد. روشصهای سنتی از قبیل حذف درختان آلوده و کنترل حشره ناقل قابلیت محدودی در مدیریت بیماری دارند. امروزه بیوتکنولوژی مولکولی روشصهای جدید و موثری برای کنترل بیمارگرها در گیاهان فراهم کرده که امکان تولید گیاهان تراریخته مقاوم به فیتوپلاسما با کمک پلانتیصبادی یکی از این موارد می باشد. در این تحقیق تولید پل آنتی بادی های اختصاصی علیه این بیمارگر در گیاه مورد پژوهش قرار گرفته است. به منظور تداخل در فرایند بیماری زایی پاتوژن در گیاه، پروتیین غشایی فایتوپلاسمای عامل بیماری جاروک لیمو ‭Immunodominant membrane protein (IMP) ‬به عنوان آنتی ژن هدف انتخاب گردید. این پروتیین در مقادیر بالا در سطح سلول فایتوپلاسما حضور دارد و نقش مهمی در فرایند بیماری زایی و انتقال با حشره ناقل دارد. جداسازی و همسانه سازی ژن تولید کننده ‭IMP ‬به کمک پرایمرهای اختصاصی صورت پذیرفت و سپس تولید انبوه پروتیین مربوطه در میزبان باکتریایی به صورت نوترکیب انجام گرفت. خالص سازی پروتیین نوترکیب با روش کروماتوگرافی تمایلی و با استفاده از ستون نیکل صورت پذیرفت و از پروتیین خالص به منظور تولید آنتی بادی های اختصاصی پلی کلونال و مونوکلونال استفاده گردید. جهت تولید آنتی بادی پلی کلونال، تزریق مستقیم پروتیین نوترکیب خالص ‭IMP ‬به خرگوش صورت پذیرفت. در ادامه کیت تشخیصی الیزا به منظور شناسایی بیماری در باغات آلوده تولید گردید. برای این منظور ابتدا آنتی بادی از سرم خون جداسازی و با استفاده از ستون پروتیین ‭A ‬خالص سازی گردید و اتصال آنتی بادی به آنزیم آلکالین فسفاتاز صورت پذیرفت. با استفاده از آنتی بادی های خالص و کانژوگه تولید شده در این تحقیق فرایند تشخیص نمونه های آلوده با روش های ‭DAS-ELISA ‬و ایمونو دات بلات (دیبا) بهینه سازی و انجام گردید. در ادامه با توجه به لزوم شناسایی درختان آلوده در مراحل اولیه آلودگی و اهمیت ارتقا حساسیت سیستم شناسایی، کیت تشخیصی نانوبیوسنسور کوانتوم دات مبتنی بر‭(FRET) fluorescence resonance energy transfer ‬نیز بر مبنای آنتی بادی های تولید شده طراحی و اجرا گردید. برای این منظور ابتدا اتصالات اولیه آنتی بادی به کوانتوم دات و آنتی ژن نوترکیب به پروتیین ردامین صورت پذیرفت و در نهایت شناسایی نمونه های آلوده گیاهی بر مبنای حضور سلول های فایتوپلاسما در بافت های آلوده با انجام عصاره گیری و سپس خوانش توسط دستگاه فلوریمتر انجام گرفت. نتایج این قسمت از تحقیق حاکی از ارتقا حساسیت سیستم تشخیصی حاصله به حدود ‮‭1000‬ برابر روش الیزا می باشد. علاوه بر این استفاده از سیستم مذکور باعث افزایش قابل توجه سرعت در شناسایی نمونه های آلوده گردید به نحوی که تمامی مراحل ردیابی نمونه های آلوده در مدت ‮‭10‬ دقیقه قابل انجام می باشد. در ادامه به منظور تولید آنتی بادی های نوترکیب مونوکلونال، از آنتی ژن پروتیین نوترکیب ‭IMP ‬برای تولید آنتی بادی با استفاده از تکنولوژی ‭Phage display ‬صورت پذیرفت. برای این منظور از کتابخانه های ژنی آنتی بادی که حاوی ترادف اختصاصی ناحیه متغیر آنتی بادی های انسانی می باشد استفاده گردید. در این کتابخانه های ژنی، ژن کد کننده آنتی بادی به صورت متصل به ژن پروتیین پوششی فاژ در ژنوم وجود دارد و پروتیین مربوطه در سطح پیکره های باکتریوفاژ قرار می گیرد. با استفاده از تکنولوژی نمایش فاژی ژن های آنتی بادی های اختصاصی مونوکلونال از کتابخانه های مذکور جداسازی گردیده و قابلیت اتصال پروتیین مربوطه به نمونه های آنتی ژن نوترکیب و همچنین تشخیص نمونه های گیاهی آلوده با روش های سرولوژیک مورد بررسی و تایید قرار گرفت. به منظور بررسی قابلیت بیان ژن آنتی بادی در گیاه ابتدا همسانه سازی آن در ناقلین بیانی گیاهی صورت پذیرفت. ژن رمزکننده این آنتی-بادی در ناقلهای بیانی گیاهی تحت کنترل پروموتر دایمی ‮‭35‬‭S ‬یا پروموتر ‭Coconut foliar decay virus (CFDV) ‬اختصاصی آوند آبکش در سازهصهای ژنی همراه و یا بدون سیگنال پپتید قرار گرفت و بیان پروتیین در آپوپلاست و سیتوپلاسم سلول گیاهی بررسی شد. آنالیزهای وسترنصبلات تولید پلانتیصبادی-هایی با اندازه پیشصبینی شده را تایید نمود. در ادامه خالص سازی پل آنتی بادی از گیاهان تولید کننده آنتی بادی با روش کروماتوگرافی تمایلی و بر روی ستون نیکل صورت پذیرفت. در ادامه توانایی اتصال پل آنتیصبادیصها به ‭IMP ‬با آزمون های سرولوژیک مورد بررسی و تایید قرار گرفت. نتایج حاصله نشان داد که آنتیصبادی ‭scFvIMP‬6 کاندیدای مناسبی برای انتقال پایدار به گیاه لیموترش جهت ممانعت از بیماری جاروک در گیاه می باشد. در ادامه تحقیق، فرایند کشت بافت لیمو ترش با انجام تیمارهای مختلف در مراحل مختلف شاخه زایی و ریشه دهی بهینه سازی گردید و همچنین سازه های بیانی گیاهی حاوی ژن آنتی بادی برای انتقال ژن به گیاه لیمو ترش مورد استفاده قرار گرفت. واژه های کلیدی: جاروک لیمو، فیتوپلاسما، آنتی بادی نوترکیب، مهندسی ژنتیک،‭scFv