بررسی تظاهر ژن های مهم درگیر در تولید بیوفیلم و کنترل بیولوژیک در سویه های بومی Bacillus subtilis در شرایط آنتاگونیستی
صاحب اثر: سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی
نوع محتوی: طرح پژوهشی
زبان: فارسی
استان موضوع گزارش: البرز
شهر موضوع گزارش: کرج
شناسه ملی سند علمی: R-1059616
تاریخ درج در سایت: 27 بهمن 1397
دسته بندی علمی: علوم کشاورزی
مشاهده: 229
تعداد صفحات: 174
سال انتشار: 1389
نسخه کامل طرح پژوهشی منتشر نشده است و در دسترس نیست.
- من نویسنده این مقاله هستم
استخراج به نرم افزارهای پژوهشی:
چکیده طرح پژوهشی:
باکتری Bacillus subtilis یک باکتری گرم مثبت، میلهصای شکل و تولید کننده اندوسپور است که به دلیل داشتن قابلیتصهای بالا در کنترل بیولوژیک بیماریصهای گیاهی همواره مورد توجه دانشمندان بوده است. یکی از نکات مبهم در انتخاب یک سویه B. subtilis به عنوان عامل بیوکنترل بیمارگرها، نقش بیوفیلم در کارایی سویهصها میصباشد. علاوه بر این مکانیسم تشکیل بیوفیلم در این باکتری بطور کامل شناسایی نشده است. لذا موضوع این تحقیق با هدف تعیین نقش بیوفیلم در شرایط آنتاگونیستی باکتری و شناسایی ژنصهای جدید احتمالی موثر در تشکیل بیوفیلم مطرح گردید. بدین منظور، در ابتدا توان آنتاگونیستی 30 جدایه بومی B. subtilis در کنترل بیولوژیک بیماری پوسیدگی معمولی ریشه گندم ناشی از قارچ Fusarium culmorum مورد ارزیابی قرار گرفت. کلیه جدایهصها در برابر قارچ ایجاد هاله بازدارنده نمودند اما در تولید متابولیت فرار ضدقارچی تنوع نشان دادند. ارزیابی تولید پروتیاز و بیوفیلم در جدایهصها نشان داد همه جدایهصها قادر به تولید پروتیاز و بیوفیلم در پلیت پلیصاستیرن بودند، با این حال تنوع زیادی در بین جدایهصها دیده شد. آزمون تاثیر جدایهصها بر شاخصصهای بذر نشان داد بیشتر آنصها موجب افزایش سرعت جوانهصزنی بذر، شاخص ویگور-طول و وزن خشک گیاهچه شدند. نتایج حاصل از بررسیصهای گلخانهصای روی 15 جدایه انتخاب شده، نشان داد %73 جدایهصها ریشه گندم را بیش از 107 cfu/gا3 کلنیزه نمودند. در آزمون کنترل بیولوژیک بیماری در گلخانه، کلیه جدایهصها توانستند بین 100-%16 بیماری را کاهش دهند. بین میزان کلنیزاسیون و کنترل بیولوژیک بیماری در گلخانه با تولید بیوفیلم به ترتیب %68 و %56 همبستگی وجود داشت. پس از تعیین توالی قطعهصای از ژن 16S rRNA به اندازه 600-900 جفتصباز، کلیه جدایهصهای مورد مطالعه به عنوان جدایهصهای بومی ایران در GenBank با شمارهصهای دستیابی 32-HQ197378، HQ234318 و 64-HQ267751 ثبت شدند. در بررسی روابط فیلوژنیک بین جدایهصهای مورد مطالعه بر اساس روش نزدیکصترین همسایه و با استفاده از 600 جفتصباز ژن 16S rRNA، کلیه جدایهصها در یک گروه و مجزا از توالی خارج گروه قرار گرفتند. این گروه به دو زیرگروه تقسیم شد. هیچصگونه رابطهصای بین زیرگروهصهای تشکیل شده در دندروگرام فیلوژنی با نتایج بدست آمده در بررسیصهای آزمایشگاه و گلخانه بدست نیامد. در این مطالعه برای اولین بار آنالیز کمی بیان ژنصهای sinR (ممانعت کننده اصلی تشکیل بیوفیلم) و tasA (کد کننده مهمترین پروتیین ماتریکس بیوفیلم) در حضور قارچ بیمارگر با استفاده از روش Real time PCR بررسی گردید. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد، قارچ بیمارگر موجب تغییر بیان ژنصها در جهت تشکیل بیوفیلم بیشتر در باکتری B. subtilis میصگردد. بیان ژن sinR در تیمار قارچ- باکتری نسبت به تیمار باکتری کاهش یافت و این روند کاهشی در مراحل مختلف نمونهصبرداری به میزان 65/،44 0/،0/34 0 و 0/29 بود. در مورد ژن tasA حالت عکس اتفاق افتاد و این قارچ موجب افزایش بیان این ژن در مراحل رشد آزاد و تولید بیوفیلم به میزان 98/،44 2/،4/37 3 و 5/63 برابرگردید. در بخش دیگر این پژوهش، تولید موتانت به منظور شناسایی ژنصهای جدید مرتبط با تولید بیوفیلم در استرین 168 B. subtilis، با استفاده از ترانسپوزون mini-Tn10 انجام شد. مقایسه توالی موتانت ایجاد شده با توالی تیپ وحشی در GenBank نشان داد، موتاسیون در ژن ykuT رخ داده است. با توجه به عدم توانایی استرین موتانت در تشکیل بیوفیلم کامل نسبت به استرین تیپ وحشی، در این مطالعه ژن ykuT برای اولین بار به عنوان یکی از ژنصهای مهم در تولید بیوفیلم باکتری B. subtilis معرفی گردید. در ادامه تاثیر محیط کشتصهای مختلف آزمایشگاهی بر بیان ژن ykuT در روش FACs ارزیابی شد. برای این منظور پروموتر این ژن به پلاسمید pSG1151 که حامل ژن gfp بود، الحاق گردید. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که محیط حداقل Spizizen salt موجب کاهش و محیط کشتصهای TYG، TYN و 2xSG موجب افزایش بیان این ژن شدند. در بررسی تاثیر ژن ykuT بر بیان اپرون spoIIA و ژن hag به ترتیب فاکتورهای موثر در اسپورزایی و تحرک باکتری B. subtilis، پلاسمید pSG1151 حامل پروموتر ژنصهای مورد مطالعه به استرین تیپ وحشی 168 B. subtilis و موتانت ykuT::spc معرفی گردید. در این آزمایش مشخص شد بیان اپرون spoIIA و ژن hag تحت تاثیر ژن ykuT قرار داشته و عدم وجود ژن ykuT موجب توقف بیان ژن موردنظر میصگردد. مقایسه تحرک و اسپورزایی استرینصهای تیپ وحشی و موتانت، همچنین عکسصبرداری با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت نتایج بالا را تایید نمود. واژه های کلیدی: بیوفیلم، کنترل بیولوژیک، Bacillus subtilis، ژن ykuT، ژن sinR و ژن tasA.