گزارش نهایی طرح تحقیقاتی بررسی بیوتکنولوژی قارچ های اندوفایت

از آنجا که کشور ما در مناطق خشک و نیمه خشک واقع گردیده است، لذا گیاهان در این منطقه نیازمند استفاده از مکانیسمهای خاصی برای امکان بقا و تداوم حیات خویش میباشند. قارچهای اندوفایت همزیست که برای اولین بار در کشور توسط مجری طرح مورد بررسی قرار گرفته است، منبع عظیم و پتانسیل قابل توجهی برای کشاورزی است که در کشور ما میتوان از آن بهره جست. این قارچ ها عامل اعطای مقاومت در جنبههای مختلف تنشهای زیستی و غیرزیستی به گیاهان میزبان میباشند. قارچهای اندوفایت جنس نیوتایفودیوم‭( (Neotyphodium ‬عضو خانواده ‭Clavicipitaceae ‬هستند که با بیشتر گونه های گراسهای سردسیری رابطه همزیستی دارند. این قارچ ها به عنوان یک عامل بیولوژیک ویژگی های مورفولوژیک و فیزیولوژیک و اکولوژیک گیاهان میزبان را تغییر داده و باعث بهبود رشد و افزایش پایداری آنها در برابر تنشصهای زنده و غیر زنده می شوند. این قارچها از طریق تولید برخی از ترکیبات به میزبان خود کمک می کنند. به دلیل اهمیت فوق العاده این رابطه همزیستی طرحی با شش زیرطرح (پروژه) در جنبه های مختلف انجام گرفت. به منظور مطالعه تنوع ژنتیکی اندوفایت های گراس ایران، از نشانگر مولکولی ‭SSR ‬برای بررسی‮‭19‬ ایزوله قارچ اندوفایت جداسازی شده از گیاهان فسکیوی بلند و ری گراس چندساله استفاده شد. گیاهان انتخابی به هشت منطقه مختلف کشور تعلق داشتند. تجزیه کلاستر با استفاده از داده های مولکولی، ایزوله های قارچ اندوفایت را در پنج گروه مجزا دسته بندی نمود. در مجموع، سطح بالای چندشکلی را بین ایزوله های ‭Neotyphodium ‬و ‭Epichloe ‬با استفاده از نشانگرهای مولکولی ‭SSR ‬بدست آمد. همچنین فاصله ژنتیکی بین ایزوله های قارچ اندوفایت نشان داد که رابطه مستقیمی بین فاصله ژنتیکی ایزوله های قارچ اندوفایت و فاصله جغرافیایی آنها وجود دارد. در کل نتایج این تحقیق نشان داد که نشانگرهای مولکولی ‭SSR‬، برای بررسی تنوع ژنتیکی بین گونه های قارچ اندوفایت مناسب بوده و می توانند برای رده بندی و تعیین فواصل ژنتیکی جمعیت های آنها مورد استفاده قرار گیرند. برای بررسی نقش این قارچ همزیست در مقاومت به تنش های محیطی، گیاهان حاوی قارچ اندوفایت از یک اکسشن فسکیوی بلند شناسایی و با استفاده از محلول قارچ کش دو دسته کلون حاوی و عاری از اندوفایت تهیه و برای انجام آزمایش در 5 سطح تنش ‭NaCl ‬در یک آزمایش فاکتوریل به محیط کشت هیدروپونیک منتقل شدند. نتایج مقایسه میانگین صفات مختلف نشان داد که گیاهان حاوی قارچ اندوفایت نسبت به گیاهان عاری از قارچ اندوفایت برتری نشان دادهصاند. در کل نتایج این تحقیق نشان داد که قارچ های اندوفایت نقش موثری در افزایش تحمل گیاهان میزبان در برابر تنشص شوری ایفا می-کنند. بنابراین میصتوان قارچ های اندوفایت را به عنوان یک عامل بیولوژیک مهم در افزایش کارآیی و پایداری چمنصها مورد استفاده قرار داد. به منظور بررسی روش های تلقیح مصنوعی و تعیین برترین روش با انتقال سریع قارچ از یک ژنوتیپ گیاهی به ژنوتیپ های دیگر، دو ژنوتیپ گیاهی انتخاب و قارچ های اندوفایت همزیست با آنها استخراج و از سه روش لچ و کریستن سن، قرار دادن میسلیوم قارچ در داخل بذر، روش جوهانسن-سیکالس و همکاران استفاده شد. وجود قارچ های اندوفایت در میزبان های جدید با روش های میکروسکوپی، نشانگر مولکولی ‭AFLP ‬و اصول کخ بررسی شدند. در این تحقیق روش لچ و کریستنسن با موفقیت همراه بود و تنها از طریق این روش، قارچ های اندوفایت گرفته شده از یک ژنوتیپ با موفقیت وارد همان ژنوتیپ و دیگر ژنوتیپ ها شدند. با استفاده ازسه روش دیگر، هیچ گیاهی که حاوی قارچ اندوفایت باشد، بدست نیامد. روش های بررسی گیاهان تلقیح شده در میزبان های جدید گیاهی مشخص کرد که روش های میکروسکوپی برای تشخیص وجود قارچ مناسب می باشند لیکن نشانگر ‭AFLP ‬کارایی لازم را نشان نداد. استفاده از اصل کخ نشان دادکه قارچ های اندوفایت در میزبان های جدید از لحاظ مورفولوژی و ظاهری تغییر نمی کنند. جهت تشخیص قارچهای اندوفایت همزیست با فسکیوی های بلند بومی ایران و تعیین میزان غلظت آلکالوییدهای ‭(HPLC) ‬ارگوالین و هر یک از لولینها به ترتیب با استفاده از تکنیک کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در سه مرحله از رشد، انجام شد. نتایج نشان داد که آلکالوییدهای مذکور در مرحله گرده افشانی بیشترین غلظت و ارگوالین در مرحله پنجه دهی کمترین مقدار را دارد. به منظور بررسی تاثیر قارچ های اندوفایت همزیست با گیاهان علفی در مقاومت به تنش های غیر زیستی از جمله هیدروکربن های نفتی آلوده کننده خاک، خاک دو منطقه در جنوب شرقی خلیج فارس در معرض هوا خشک گردید و آنگاه هر خاک با استفاده از سه تیمار ترکیبات نفتی نفتالین، کریزن و ترکیب نفتالین-کریزن در سه تکرار با غلظت ‮‭150‬ میلی گرم بر کیلوگرم خاک آلوده گردید. سپس گیاهان فسکیوی حاوی و عاری از اندوفایت در خاک ها کشت گردید. نتایج نشان داد که در دو نوع خاک مورد استفاده، میزان نفتالین و کریزن خاک در خاک گلدان های حاوی گیاهان دارای اندوفایت به طور معنی داری کمتر از خاک گیاهان بدون اندوفایت بود. احتمالا حذف آلودگی نفتی در گیاهان حاوی اندوفایت به دلیل بالاتر بودن ترشحات ریشه و بیشتر بودن حجم ریشه صورت گرفته است. بنابراین ممکن است بتوان با استفاده از گیاهان حاوی اندوفایت نسبت به حذف آلودگی های نفتی در خاک اقدام نمود.