بهینه سازی محیط کشت اقتصادی و شرایط تولید آنزیم فیتاز توسط سویه باسیلوس سابتیلیس بومی در مقیاس بیوراکتور آزمایشگاهی

آنزیم های فیتاز قابلیت دفسفریلاسیون مرحله ای فیتات، فراوان ترین اینوزیتول فسفات در طبیعت را دارند و در نتیجه موجب از بین رفتن خصوصیات ضدتعذیه ای آن در رژیم غذایی انسان و حیوانات می شوند. در این تحقیق ابتدا حدود 70 جدایه میکروبی از نظر مقدار تولید آنزیم فیتاز به روش تخمیر غوطه وری بررسی و غربال شدند. پس از انتخاب جدایه K46b، به عنوان تولید کننده بیشترین مقدار آنزیم فیتاز (U/mL 952/1)، شناسایی مولکولی آن با استفاده از توالی 16s rRNA انجام گرفت. توالی 16s rRNA جدایه K46b با توالی های موجود در بانک ژنی NCBI مقایسه شد و با توجه به شباهت بسیار بالا (بیشتر از 95 %) با جنس باسیلوس، به عنوان باسیلوس سابتیلیس K46b ثبت شد. سپس فعالیت کاتالیتیکی آن به روش سطح پاسخ و با استفاده از طرح مرکب مرکزی بهینه سازی شد. فعالیت آنزیم فیتاز تحت شرایط بهینه دمای ºC 5/56، pH 30/7 و غلظت فیتات سدیم 05/2 میلی مولار، U/mL 627/4 بود که در مقایسه با شرایط غربال گری حدود 137 % افزایش نشان داد. همچنین آنزیم فیتاز در محدوده وسیعی از درجه حرارت (ºC 47-68)، pH (3/6-0/8) و فیتات سدیم (04/1-50/2 میلی مولار)، 60-73 % از فعالیت بهینه خود را نشان می داد. این آنزیم مقاومت حرارتی بسیار خوبی داشت و پس از 2 ساعت نگهداری در دمای ºC 60، 60 % از فعالیت اولیه خود را حفظ کرد. همچنین در گستره وسیعی از pH (6-10) بسیار پایدار بود و پس از 24 ساعت 85-100 % فعالیت اولیه خود را حفظ کرد. بهینه سازی تولید آنزیم فیتاز در مقیاس ارلن در ابتدا به روش یک عامل در هر زمان و پس از مشخص شدن بهترین پسماندهای کشاورزی و صنایع غذایی به عنوان منابع جایگزین کربنی، نیتروژنی و اسید فیتیک به روش سطح پاسخ انجام شد. نتایج روش بهینه سازی یک عامل در هر زمان نشان داد که فسفات غیرآلی تاثیر بازدارندگی زیادی بر تولید آنزیم فیتاز داشت و دمای ºC 30، مدت زمان تخمیر 48 ساعت، کنجاله سویا و ملاس نیشکر بیشترین تاثیر بر تولید آنزیم فیتاز داشت. نتایج روش بهینه سازی سطح پاسخ نشان داد که تحت شرایط بهینه دمای ºC 30، 11/0 % یون کلسیم، 23/2 % کنجاله سویا، حدود 10 % ملاس نیشکر، 170 دور بر دقیقه و پس از 39 ساعت تخمیر، U/mL 562/56 بود که در مقایسه با محیط کشت پایه بیش از 27 برابر افزایش یافت. همچنین آنزیم فیتاز به خوبی توانست اسید فیتیک موجود در کنجاله سویا و سبوس گندم را هیدرولیز کرده و مقدار فسفات غیرآلی آنها را همزمان افزایش دهد. هر چند که افزایش مقیاس در بیوراکتور 5/1 لیتری موجب کاهش راندمان تولید آنزیم فیتاز (U/mL 567/43) نسبت به مقیاس ارلن شد ولی بهره وری آن در بیوراکتور (U/mL/h 63/3) در مقایسه با کشت ارلن در مرحله غربالی (U/mL/h 04/0) بیش از 88 برابر افزایش نشان داد. با توجه به pH قلیایی فعالیت آنزیم، پایداری حرارتی خوب و پایداری در گستره وسیعی از pH و قابلیت استفاده از کنجاله سویا و ملاس نیشکر به عنوان سوبستراهای ارزان قیمت، آنزیم فیتاز باسیلوس سابتیلیس K46b می تواند به صورت یک جایگزین بالقوه آنزیم های فیتاز تجاری در صنایع مواد غذایی، خوراک دام، طیور و آبزیان و کاهش آلودگی محیط زیست در نظر گرفته شود.واژه های کلیدی: بهینه سازی؛ ویژگی های کاتالیتیکی؛ آنزیم فیتاز؛ باسیلوس سابتیلیس؛ تخمیر غوطه وری؛ پسماندهای کشاورزی