تهیه الگوی ژنومی جدایه های سالمونلا انتریکاسرووار انتریتیدیس جمع آوری شده از کشتارگاه های تجارتی طیور ایران طی سال های ‭1388 ‬الی‭1390 ‬به روش‭VNTR (MLVA)‬

سالمونلا انتریکا با بیش از ‮‭2600‬ سروتایپ در سراسر دنیا به عنوان یکی از عوامل مهم بیماریزای با منشا غذایی شناخته می شود وتغذیه گوشت خام و یا کم پخته که در شرایط مناسبی نگهداری نشده، ممکن است منجر به آلودگی انسان گردد. تعیین سروتیپ و درمراحل بعدی تحت تیپ جدایه ها با استفاده از متدهای ژنوتایپینگ به عنوان اقدامی ضروری در راستای تقویت و تکمیل اطلاعات اپیدمیولوژیک نقش مهمی در تشخیص کانونهای شیوع و شناسایی منبع آلودگی دارد. بر همین اساس این مطالعه به منظور بررسی ساختار ژنتیکی جمعیت سالمونلا انتریکا سروار انتریتیدیس جداشده از طیور در ایران با استفاده از روش ‭MLVA (VNTR) ‬و مقایسه آن با ساختارهای جمعیتی خارج از کشور سازماندهی گردیده است. در چشم انداز آتی مطالعات کنونی، روشهای مولکولار تعیین تیپ کمک خواهد کردتا با تعیین ساختار دقیق جمعیتی جدایه ها، زمینه تولید واکسن مناسب و بومی فراهم گردد. سالمونلا انتریکا انترایتیدیس یکی از شایعترین و فراگیرترین عوامل اتیولوژیک سالمونلوز در انسان و طیور محسوب می شود. در این مطالعه تعداد ‮‭81‬ جدایه مرغ متعلق به بانک میکروبی بخش میکروب شناسی موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، تهیه شده از ‮‭18‬ فارم گوشتی و تعدادی جدایه های مجزای غیر اپیدمیک، مجموعا از 6 استان با فواصل دور جغرافیایی با استفاده از روش تجزیه تحلیل تغییرات قطعات تکرارپذیر ژنومی در لوکوسهای چندگانه ‭(MLVA) ‬مورد ارزیابی قرار گرفت. از بین لوکوسهای ‭SE‬،2 ‭SE‬،3 ‭SE‬،5 ‭SE‬،7 ‭SE‬،8 ‭SENTR‬،4 ‭SENTR‬7 تنها لوکوس ‭SE‬5 با 4 آلل و ‭SENTR‬7 با 2 آلل موفق به ثبت میزان تمایز آللیک ‮‭0/58‬ و ‮‭0/15‬ در جمعیت مورد مطالعه گردیدند. در مجموع 6 گروه ژنومی متفاوت مورد شناسایی قرار گرفت که از میان آنها 3 گروه به طور مشترک به نمونه های انسانی و دامی تعلق داشت. این وضعیت هموژن و یکنواختی جمعیت در مقایسه با گزارش تمایز بالای این لوکوسها در متون و مطالعات خارج از کشور مشخص می نماید و این فرضیه را تقویت می کند که جمعیت سالمونلا انترایتیدیس در حال گردش ایرانی ناشی از انتشار یک کلون واحد در کل کشور باشد که بالقوه می تواندبه عنوان یافته ای تاثیرگذار در اعمال سیاستهای ایمنی زایی و واکسیناسیون کشوری قلمدادگردد. با استفاده از واکنشهای زنجیره ای پلیمرازی تکثیر دی.ان.آ، تمامی قطعات ژنومی مورد نظر تکثیر یافتند و ارزیابی مشاهدات اولیه ژل الکتروفورز و تاییدهای بعدی تعیین توالی دقیق در دو جهت رفت و برگشت اعمال گردید. پس از گروه بندی های ژنومی قدرت تمایز "نایز‭" (Nie's DI) ‬در هریک از لوکوسها و و "سیمپسون‭"(Simpson's DI) ‬در مجموعه 7 لوکوسی محاسبه گردید. بر اساس نتایج 5 مورد از 7 لوکوس مورد مطالعه هیچگونه تمایزی ثبت نگردید و 2 لوکوس دیگر شامل ‭SE‬5 و ‭SENTR‬7 دارای شاخص تمایز نایز ‮‭0/58‬ و ‮‭0/15‬ بودند. در مجموع 6 گروه ژنومی شناسایی شده شاخص تمایز سیمپسون ‮‭0/66‬ را ارایه نمودند. در پی بررسیهای فراتر از محدوده عملیاتی این پروژه و بر اساس الگوی تایپینگ مبتنی بر سکانس ژنهای لوکوسهای استاندارد چندگانه ‭(MLST) ‬هیچگونه تمایزی در بین جمعیت مورد مطالعه شناسایی نگردید. این بررسی تکمیلی که بعدا با نمونه های کنترل مثبت و منفی نیز تکرار ومورد تایید قرارگرفت فرضیه کلونال بودن جمعیت حاضر سالمونلا انترایتیدیس کشوری را، بیش از پیش تقویت نمود. همچنین درکنار تحقیق اصلی فوق الذکر به عنوان یک یافته تکنیکی جانبی، این مطالعه موفق به ارایه ص یک روش بهینه و کاربردی در استخراج دی.ان.آ از سالمونلا انترایتیدیس جهت استفاده در آزمایشات ‭PCR ‬گردید. در مطالعات باکتریشناسی تحقیقی و تشخیصی همراه با محدودیتهای مالی و پرسنلی دستیابی به روشهای استخراج ژنومی اقتصادی بسیار مورد تقاضای محققان می باشد. نوکلیاز سلولی ناشی از روش استخراج جوشاندن اگر به طور مناسب غیر فعال نشده باشد ممکن است مواد ژنومی را در مراحل نگهداری مورد تخریب قرار دهد. این اتفاق ناخواسته ممکن است موجب بروز نتایج غلط در عملیات ‭PCR ‬و یا بعد از آن در سیر عملیات ارسال جهت تعیین توالی گردد. در آزمایشی مقایسه ای، دی .ان. آ سالمونلا انترایتیدیس با 4 روش استخراج شامل ؛ جوشاندن ساده، جوشاندن اصلاح شده با افزودن پروتییناز k، روش فنل کلروفرم- ایزوآمیل الکل و کیت تجاری فرمنتاز مورد مقایسه قرار گرفت. به استثنای روش جوشاندن ساده، سه روش دیگر موفق به حفظ محصول ‭PCR ‬در یک دوره ‮‭28‬ روزه نگهداری گردیدند. همانگونه که نتایج نشان داد، روش جوشاندن اصلاح شده با افزودن پروتییناز ‭k ‬توانست روشی سریع، موثر و کم هزینه در استخراج دی. ان. آ جهت آزمایشگاههای نیازمند به مقادیر بالای ماده ژنومی ارایه دهد . درپایان لازم به ذکر است، با در نظر گرفتن این واقعیت که تا کنون هیچگونه استراتژی واکسیناسون سالمونلا در کشور اتخاذ نگردیده است، شناسایی سروتیپهای غالب در گردش کشوری، که همچنین مورد بررسیهای و ارزیابی های ژنوتیپی به روشهای ‭VNTR ‬و ‭MLST ‬قرار گرفته باشندبه نحوی که بتواند معرف ساختار اصیل و واقعی جمعیتی این میکروارگانیسم در کشور باشد، آینده روشنی را در ارایه واکسنهای جدید و چند ظرفیتی در بهداشت کشور وکنترل آینده این بیماری رقم خواهد زد.