بررسی مقایسه ای ژنوم سویه های مایکوباکتریوم توبرکولوزیس و مایکوباکتریوم بوویس مورد استفاده در تولید توبرکولین ساخت موسسه رازی با استفاده از روش ‭MIRU-VNTR‬

در اواخر دهه هشتاد شمسی میزان تولید توبرکولین های گاوی و مرغی مورد مصرف دامپزشکی ساخت موسسه رازی به مرز یک میلیون و هشتصد هزار دز در سال، نزدیک گردید. موفقیت مهمی که در طول بیش از نیم قرن تولید این محصولات در ایران بیصسابقه بود. تولید صنعتی توبرکولین که در طول چند دهه اخیر تغییر چندانی نیافته است به صورت سنتی متکی بر کشت انبوه سویهصهای شناخته شده ای از باکتریصهای عضو کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس میصباشد که به جهت برخورداری از تشابه ساختاری گسترده در ژنوم و فنوتیپ و همچنین برخورداری از ساختار جمعیتی کلونال، تشخیص تفریقی میان آنها بسادگی مقدور نبوده معمولا خارج از توان آزمایشگاه های باکتری شناسی عمومی می باشد. این سویهصها که عبارت اند از سویهصهای سه گانه م. توبرکولوزیس C، ‭DT‬و ‭PN‬و سویه منفرد مایکوباکتریوم بویس ‭AN‬5 نظیر هر باکتری دیگری در جریان فرایند تقسیم سلولی و در طول زمان ممکن است متحمل تغییرات ژنتیکی گردند که میصتواند بر خصوصیات ماهوی آنها و از جمله ویژگیصهای بیوشیمیایی و ایمونولوژیکی تاثیر بگذارد. جدیدترین نوبت از موارد تهیه این سویه ها از خارج از کشور به سال ‮‭1385‬ باز می گردد که بصورت غیر رسمی و در قالب همکاری های مشترک علمی از موسسه تحقیقاتی و تولیدی واکسن ترکیه بنام ‭Etlik Veterinary Microbiological Institute ‬به موسسه رازی انتقال داده شده و در تولید توبرکولین مورد استفاده قرار گرفته اند. با در نظر گرفتن این موضوعات در مطالعه حاضر دو مبحث متفاوت اما مرتبط در ارتباط با این سویه-ها دنبال گردیده است: در مرحله نخست قابلیت های کاربردی دو استراتژی وابسته به ‭PCR ‬به نام های‭RD typing ‬و ‭MIRU-VNTR typing ‬در تعیین هویت سویهصهای مولد توبرکولین به کار گرفته شده است. استراتژی ‭RD typing ‬مورد استفاده در این تحقیق خود از مجموعه ای از آزمون های مستقل را شامل می گردد که بخش هایی از مناطق شناخته شده ژنوم مایکوباکتریوم ها بنام های ‮‭16‬‭S rRNA‬، ‭Rv‬‮‭0577‬ ، ‭IS‬‮‭6110‬ و ‭RD‬1، ‭RD‬4، ‭RD‬9 و ‭RD‬‮‭12‬ را مورد هدف قرار می دهند که انجام آنها امکان احراز هویت قطعی باکتری تحت مطالعه از نظر عضویت در جنس مایکوباکتریوم و گروه م. توبرکلوزیس و همچنین تعیین گونه آن را فراهم میصسازد. از طرف دیگر استراتژی‭typing MIRU-VNTR ‬به کار رفته در این مطالعه از الگوریتمی استفاده می نماید که تعداد تکرارهای قطعات خاصی از ژنوم را در ‮‭10‬ منطقه ژنتیکی به نام های‭ETRA‬، ‭ETRB‬، ‭ETRC‬، ‭ETRD‬، ‭ETRE‬، ‭ETRF‬، ‭MIRU‬،‮‭10‬ ‭MIRU‬،‮‭26‬ ‭MIRU‬،‮‭40‬ ‭QUB‬‮‭11‬‭b ‬نشان می دهد. در مبحث دوم مجددا این دو راهبرد به خدمت گرفته میصشوند تا اینصبار ساختار ژنومی شناخته شده این سویه ها با آنچه که بصورت مشابه در خارج از این در مورد آنها شناخته و معرفی شده است مقایسه و اهمیت کاربردی آنها مورد بررسی قرار گیرد. اجرای موفقیت آمیز این مطالعه علاوه بر فراهم کردن امکان تدوین پروتکل های کاری آزمایشگاهی و از جمله نحوه تهیه نمونه ‭DNA ‬ژنومی مناسب به روش جوشانیدن بدون نیاز به اجرای روش طولانی و شناخته شده "مشهور به روش ‭CTAB"‬، منجر به دستیابی یافته های مهمی گردید که از جمله آنها می توان به موارد ذیل اشاره نمود: 1) ضمن تایید هویت سویه های سه گانه انسانی م. توبرکلوزیس ‭DT‬،C، و ‭PN ‬بعنوان اعضای گروه م. توبرکلوزیس نشان داده شد که این سویه ها با استفاده از راهبرد مورد استفاده در تحقیق حاضر قابل افتراق از سویه گاوی م. بوویس ‭AN‬5 می باشند. 2) الگوی ژنتیکی هر سه سویه انسانی موسسه رازی با یکدیگر و با اطلاعات منتشر شده از سویه م. توبرکلوزیس ‭DT ‬اجدادی موجود در موسسه ویبریج انگلستان در 6 لوکوس ‭ETRA‬، ‭ETRB‬، ‭ETRC‬، ‭ETRD‬، ‭ETRE‬، ‭ETRF ‬مطابقت و همخوانی دارد، 3) در میان سه سویه انسانی ژنوم سویه های م. توبرکلوزیس ‭C ‬و م. توبرکلوزیس ‭DT ‬و م. توبرکلوزیس C‮‭1336‬ (نمونه آرشیوی لیوفلیزه از سویه م. توبرکلوزیس‭C ‬وارد شده از موسسه ویبریج انگلستان مربوط به سال ‮‭1336‬) و همچنین م. توبرکلوزیس ‭PN ‬از نظر تعداد تکرارهای ژنتیکی در 9 لوکوس از لوکوس های ‮‭10‬ گانه مورد بررسی در این تحقیق به نام های‭ETRA‬، ‭ETRB‬، ‭ETRC‬، ‭ETRD‬، ‭ETRE‬، ‭ETRF‬، ‭MIRU‬،‮‭10‬ ‭MIRU‬،‮‭26‬ ‭MIRU‬‮‭40‬ با یکدیگر مطابقت کامل دارند و امکان افتراق آنها با این استراتژی میسر نمیصباشد. اما م. توبرکلوزیس ‭PN‬، م. توبرکلوزیس ‭C ‬و م. توبرکلوزیس C‮‭1336‬ در لوکوس ‭QUB‬‮‭11‬‭b ‬با م. توبرکلوزیس ‭DT ‬قابل افتراق می باشند بطوریکه اندازه قطعه ‮‭10‬‭-MIRU ‬در سه سویه نخست موجود در موسسه رازی ‮‭412‬ ‭bp ‬و طول همین این قطعه در سویه ‭DT ‬موسسه ‮‭343‬ ‭bp ‬می باشد. 4) بررسی مقایسه ای میان دو پاساژ متفاوت از سویه های م. توبرکلوزیس ‭PN ‬و م. توبرکلوزیس ‭C ‬موجود در موسسه رازی تنها در دو لوکوس ‭MIRU‬،‮‭26‬ ‭MIRU‬‮‭10‬ تفاوت های را نشان داد. استناد به نشانه های دیگر از جمله مقایسه ساختار ژنتیکی این سویه ها در لوکس های تحت مطالعه با آنچه از جدایه های کلینیکی جمع آوری شده از گاو در موسسه رازی موجود می باشد شانس بروز حالت آلودگی اتفاقی در جریان تجدید کشت سویه های تولیدی توبرکولین را بسیار کم اهمیت نشان می دهد. آیا این تفاوت های محدود نشانه بروز موتاسیون در ژنوم این سویه ها پس از ورود آنها به موسسه رازی و یا پیش از آن می باشند، پاسخ به این سوال خارج از مقدورات و یافته های تحقیق حاضر بنظر می رسد. 5) در مورد سویه گاوی م. بویس ‭AN‬5اندازه قطعه ‭ETR-E ‬سویه فعلی موجود در موسسه رازی به طول ‮‭171‬ ‭bp ‬از اندازه همین قطعه ‮‭224‬ ‭(bp (‬در سویه اجدادی آن متعلق به موسسه ویبریج انگلستان (خواستگاه اولیه این سویه) کوچک تر به نظر می رسد علاوه بر ، اندازه قطعه ‭ETR-F ‬سویه فعلی موجود در موسسه رازی ‮‭414‬ ‭bp ‬می باشد حال آنکه همین لوکوس در سویه موجود در ویبریج به طول ‮‭469‬ ‭bp ‬گزارش گردیده است. چون تاکنون اطلاعاتی در ار