جداسازی و شناسایی باکتری های جنس استرپتومایسس دارای اثرات ضدباکتریایی و ضدقارچی از خاک های مناطق شمال غرب کشور

استرپتومایسس ها معروف ترین رده اکتینومایستال ها هستند ، بیش از ‮‭600‬ گونه از این جنس تولید کننده آنتی بیوتیک های معروف و دیگر متابولیت های ثانویه می باشد. تاکنون بیش از ‮‭23000‬ متابولیت ثانویه فعال از میکروارگانیسم ها گزارش شده است. حدود ‮‭10000‬ از این متابولیت ها از اکتینومیست ها تولید می شوند و در میان این ها ‮‭7600‬ نوع آنها از استرپتومایسس ها تولید می شوند . در کنار آنتی بیوتیک های ضد باکتریایی، استرپتومایسس ها مواد جالب بسیاری تولید می کنند، ازجمله، مواد ضدقارچی، ضد ویروسی، ضد تومور، ضد انگل، حشره کش و علف کش ... استرپتومایسس ها قادر به تولید انواع مختلف آنزیم های کیتیناز می باشند. کیتینازهای تولیدی استرپتومایسس ها به دو خانواده ‮‭18‬ و ‮‭19‬ گلیکوزیل هیدرولازها تعلق دارند. معمولا فعالیت ضدقارچی را کیتینازهای خانواده ‮‭19‬ نشان می دهند و در مقایسه با کیتینازهای باکتریایی خانواده ،‮‭18‬ فعالیت هیدرولیز کننده ویژه کیتیناز ‭C ‬که یک کیتیناز خانواد ‮‭19‬ می باشد، در برابر هر دو نوع کیتین محلول و غیرمحلول به طور قابل ملاحظه ای بالاتر بوده است. با توجه به وجود درصد بالایی از کیتین در دیواره سلولی قارچ ها، آنزیم کیتیناز به عنوان یک عامل کنترل زیستی موثر برعلیه قارچ های فیتوپاتوژن به عنوان جایگزین استفاده از سموم شیمیایی محسوب می گردد. در همین راستا ابتدا غربالگری برای فعالیت ضدباکتریایی ونیز شناسایی مولکولی باکتری های استرپتومایسس جدا شده بااستفاده از ژن ‮‭16‬‭SrRNA ‬انجام شد.در این بررسی ایزوله های اکتینومیست از نمونه خاک های جمع آوری شده شمالغرب کشور جدا سازی شد و غربالگری اولیه به روش تست دولایه ‭(Bilayer) ‬درمحیط کشت اگار در مقابل میکروارگانیسم های آزمایشی: ‮‭29213‬ ‭E. coli ATCC ‬،‮‭1399‬ ‭K. pneumoniae ATCC ‬،‮‭1290‬ ‭S. flexneri ATCC ‬،‮‭1234‬ ‭L. monocytogenes ATCC ‬،‮‭33090‬ ‭B. cereus ATCC ‬،‮‭1431‬ ‭Y. enterocolitica ATCC‬،‮‭35669‬‭andS. aureus ATCC ‬انجام گرفت. در غربالگری ثانویه، نمونه هایی که فعالیت قوی داشتند برای استخراج مواد ضد باکتریایی انتخاب شدند. متابولیتهای حاصل از این باکتری ها در مقابل میکروارگانیسم های آزمایشی : ‮‭29213‬ ‭E. coli ATCC ‬،‮‭1399‬ ‭B. cereus ATCC ‬،‮‭1431‬ ‭Y. enterocolitica ATCC‬‮‭35669‬ ‭and S. aureus ATCC ‬با روش انتشار در اگار‭(Disk Diffusion Method) ‬آزمایش شدند. جهت شناسایی مولکولی، ابتدا ‭DNA ‬ژنومیک از تمام باکتری های منتخب با خاصیت ضد باکتریایی قوی استخراج شد و سپس، ژن ‮‭16‬‭SrDNA ‬ایزوله های مذک ور با تکنیک ‭PCR ‬تکثیرو به وکتور ‭pTZ‬‮‭57‬‭R/RT ‬انتقال یافت و توسط میزبان ‭E. coli DH‬5 همسانه سازی شد. پلاسمید نوترکیب استخراج شده ازباکتری ها توسط شرکت ‭Macrogene ‬توالی یابی شد. نتایج حاصل با استفاده از برنامه های بیوانفورماتیک آنالیز وایزوله های مذکور شناسایی شدند. از ‮‭1000‬ نمونه خاک جمع آوری شده ، ‮‭1371‬ ایزوله اکتینومیست جدا سازی شد، درغربالگری اولیه، از ‮‭1371‬ ایزوله، ‮‭159‬ ایزوله در مقابل میکروارگانیسم های آزمایشی فعالیت ضد باکتریایی نشان دادند و در غربالگری ثانویه از ‮‭36‬ ایزوله انتخاب شده ، ‮‭12‬ نمونه که فعالیت ضد باکتریایی قوی داشتند برای استخراج مواد ضد باکتریایی انتخاب شدند که دراین غربالگری ، 7 ایزوله، در مقابل همه میکروارگانیسم های آزمایشی از خود فعالیت آنتی باکتریایی قوی نشان دادند. توالی یابی ژن ‮‭16‬‭SrRNA ‬ایزوله های استان آذربایجان شرقی نشان داد که به ترتیب(‮‭1-9-5-1‬و‮‭1-4-20-1‬ )به گونه های ‭Streptomyces sampsonii ‬و ‭Streptomyces mediolani‬شباهت صد در صد یکسانی دارند همچنین ایزوله ‮‭5-4-11-1‬با نودونه درصد شباهت به گونه ‭Streptomyces albogriseolus ‬و ایزوله ‮‭1-5-16-1‬با هشتادودودرصد شباهت به گونه ‭Streptomyces lividans ‬تعلق دارد که همگی در بانک اطلاعات ژن ‭NCBI ‬ثبت گردیدند. از استان های دیگر باکتری ها با عنوان ‭Streptomyces calvus ‬و ‭Streptomyces levis ‬شناسایی گردید و به علت اینکه در آزمایشات نتایج مناسبی را داشته اند .برای این ایزوله ها در روش ‭HPLC ‬علاوه بر ساختارهای مشترک، دیگر فراکشن ها نیز به صورت جداگانه مشخص گردید. نتایج این تحقیق نشان می دهد ایزوله های جدیدی در نمونه خاک های استان شمالغرب کشور به وفور وجود دارد که توانایی تولید مواد آنتی باکتریایی جدیدی دارند. جهت بررسی خاصیت ضد قارچی استرپتومایسس سعی بر این بوده است از خاک بعضی از استانهای شمالغرب کشور با تکیه بر شناسایی مولکولی ژن کیتیناز خانواده ‮‭19‬ در این باکتری ها مورد بررسی قرار گیرد. به دنبال بررسی ‮‭170‬ نمونه خاک از این ایزولاسیون ابتدا ‮‭386‬ ایزوله باکتری انجام گرفت و سپس از این تعداد ایزوله استخراج ‭DNA‬، جهت تکثیر ژن کد کننده آنزیم کیتیناز ،‮‭19‬ ‭PCR ‬انجام گرفت. از میان ‮‭25‬ ایزوله ای که نتیجه مثبت نشان دادند (کردستان: 7 ایزوله، اردبیل: ‮‭10‬ ایزوله،آذربایجان شرقی:4 ایزوله،آذربایجان غربی4ایزوله)، یکی به تصادف انتخاب شد. این ایزوله از خاک منطقه دیوان دره کردستان جداسازی شده بود. قطعه تکثیری مربوط به ژن کیتیناز ‮‭19‬ ایزوله مذکور در وکتور ‭pGEM-T ‬و درون باکتری ‭E.coli DH‬5 همسانه سازی و سپس توالی یابی گردید. بررسی های بیوانفورماتیکی آشکار کرد که ژن کیتیناز خالص سازی شده، %‮‭96‬ تشابه با ژن کیتیناز ‭C ‬باکتری ‭Streptomyces griseus ‬دارد. در نهایت از طریق توالی یابی ژن ‮‭16‬‭S rDNA ‬ایزوله مذکور، تایید گردید که باکتری جدا شده از خاک کردستان که مولد آنزیم کیتیناز خانواده ‮‭19‬ می باشد، به جنس استرپتومایسس تعلق دارد. محصول ‭PCR ‬ژن ‮‭16‬‭S rDNA ‬جدایه مولد کیتیناز ‮‭19‬ در وکتور ‭pTZ‬‮‭57‬‭R/T ‬و درون باکتری ‭E.coli DH‬5 کلون گردیده و توالی یابی شد. قطعه ‮‭16‬‭S rDNA ‬کلون شده با توالی ‮‭43‬ ،‮‭16‬‭S rDNA ‬استرین مختلف جنس استرپتومایسس تشابه %‮‭99‬ نشان داد.