جهش زایی هدف دار در لوپ ۶ سوپر اکسید دیسموتاز ۱ انسانی به منظور بررسی خصوصیات آنزیم جهش یافته

سوپر اکسید دیسموتاز۱ انسانی (hSOD۱) یک آنزیم آنتی اکسیدانی است که رادیکال سوپر اکسید را به هیدروژن پراکسید و اکسیژن تبدیل می کند. بیش از ۱۰۰ جهش در این آنزیم یافت شده ا ست که باعث بیماری ا سکلروز جانبی آمیوتروفیک (ALS) می شوند. هدف از این پژوهش برر سی تاثیر جهش L۱۰۶V واقع در لوپ سوپر اکسید دیسموتاز بر ساختار و فعالیت آن می باشد. از ژن سوپر اکسید دیسموتاز موجود در پلاسمید pET-۲۸a(+) به عنوان الگو برای جهش زایی هدف دار با روش Quick-change PCR استفاده شد. پس از تایید جهش ، پلاسمید حاوی جهش به باکتری بیانی E.coli سویه ی BL۲۱(DE۳) انتقال داده شد . برای بیان پروتئین از القا کننده های IPTG و لاکتوز استفاده شد . خالص سازی پروتئین به روش کروماتوگرافی تمایلی نیکل-سفارز انجام شد و برای تعیین خلوص پروتئین از ژل SDS_PAGE استفاده شد. تعیین فعالیت ویژه آنزیم جهش یافته و وحشی با استفاده از سوبسترای پیروگال ول در طول موج ۴۲۰ نانومتر با روش اسپکتروفتومتری انجام شد. مطالعات ساختاری با کمک تکنیکهای فلورسانس ذاتی وفلور سانس خارجی با ن شانگر ANS انجام شد. نتایج حا صل از این مطالعه ن شان می دهد که فعالیت ویژه آنزیم وح شی و جهش یافته L۱۰۶V به ترتیب ۷۰۳۱/۲۵ U/mg و۷۲۳۸/۶۵ /mg است. مطالعات ساختاری با فلور سانس ذاتی نشان داد که شدت نشر فلور سانس ذاتی جهش یافته L۱۰۶V به طور جزئی کمتر از حالت وحشی است. افزایش شدت نشر فلورسانس خارجی در جهش یافته ی L۱۰۶V نسبت به حالت وحشی بیانگر دسترسی بیشتر پاکت های سطحی هیدروفوب به ANS می با شد. بنابراین جهش L۱۰۶V در ژن سوپراک سید دی سموتاز به عنوان عامل ژنتیکی مرتبط به شکل ارثی اسکلروز جانبی آمیوتروفیک می باشد.