بهینه سازی روش های مولکولی شناسایی نماتد عامل ریشه گره ای (Meloidogyne javanica)

به منظور شناسایی سریع مراحل مختلف رشدی گونه Meloidogyne javanica که در ایران به عنوان یکی از خسارتزاترین نماتدهای گیاهی شناخته شده، تعداد ۴۰ نمونه خاک و ریشه آلوده به نماتد ریشه گره ای از نقاط مختلف جالیزکاری استان فارس (داراب، جنت شهر، استهبان، نورآباد، کوار و شیراز) جمع آوری گردید. پس از خالص سازی به روش تک کیسه تخم روی ریشه گوجه فرنگی رقم Rutgers و شناسایی گونه M. javanica بر اساس ویژگی های ریخت شناسی (مورفولوژی) و ریخت سنجی ماده های بالغ و لارو سن دوم، DNA ژنومی کلیه مراحل رشدی از مرحله تخم، لارو سن دوم و ماده های بالغ نماتد، به سه روش ژانگ، سیلوا و لیوآ استخراج شد. DNA استخراج شده با کمک جفت آغازگرهای اختصاصی گونه Fjav/Rjav, Mj-MF/Mj-MR, Mj-DF/Mj-DR  تکثیر گردید. در کلیه مراحل رشدی گونه M. javanica یک قطعه ۱۶۵۰ جفت بازی توسط جفت آغازگر Mj-DF/Mj-DR ، یک قطعه ۵۱۷ جفت بازی توسط جفت آغازگر Mj-MF/Mj-MR و یک قطعه ۶۷۰ جفت بازی توسط جفت آغازگر Fjav/Rjav تکثیر شد ولی این قطعات با جفت آغازگر MI-F و MI-R، مربوط به نماتد M. incognita و آب که به عنوان کنترل منفی در آزمایش استفاده شده بودند تکثیر نشدند. لذا به نظر می رسد کاربرد این جفت آغازگرها در قیاس با خصوصیات ریخت شناسی در مراحل مختلف رشدی نماتد به تشخیص سریع تر گونه M. javanica منجر می شود. در بهینه سازی PCR برای تشخیص نماتد M. javanica بهترین دما برای آغازگرهای Mj-MF و Mj-MR، ۵۶ درجه سانتی گراد برای Mj-DF و Mj-DR، ۵۰ درجه سانتی گراد و برای Fjav و Rjav، ۵۴ درجه سانتی گراد تعیین گردید، میزان DNA الگو حاصل از روش های مختلف استخراج در آزمون PCR در خصوص ماده کامل و کیسه تخم از یک میکرولیتر به دو میکرولیتر و لارو سن دوم از دو میکرو لیتر به چهار میکرولیتر بهترین نتیجه حاصل شد. در خصوص MgCl۲ با افزایش میزان آن از ۵/۱ میلی مولار به ۲ میلی مولار در واکنش ۲۵ میکرولیتری PCR بهترین نتیجه حاصل گردید. بهترین روش استخراج که قادر به ردیابی تک لارو سن دوم نماتد بود روش لیوآ در نظر گرفته شد. بهترین آغازگرها که قادر به ردیابی نماتد  M. javanicaدر تمام مراحل رشدی بودند، جفت آغازگرMj-MF/Mj-MR و Fjav/Rjav بودند.