شناسایی قارچ Polymyxa betae در ریشه های چغندرقند با استفاده از روش مولکولیRT-PCR در استان خراسان رضوی

چکیده قارچ پلی میکسا بتا (Polymyxa betae) از پارازیتهای اجباری و انتشار جهانی دارد. این قارچ خاکزاد و پارازیت داخلی ریشه برخی گیاهان مانند اعضاء خانواده های خرفه (Portulaceae)، سلمه (Chenopodiaceae)، تاج خروسیان (Amaranthaceae) و ناقل تعدادی از ویروسهای بیماریزای گیاهی از جمله ویروس زردی نکروتیک رگبرگ چغندرقند(BNYVV) می باشد. این ویروس از لحاظ اقتصادی از مهمترین ویروسهای آلوده کننده چغندرقند است. اسپورهای این قارچ قادرند سالها در خاک خشک باقی بمانند. با توجه به اهمیت این ویروس، در تابستان ۱۳۸۴ اقدام به جمع آوری خاک و نمونه های مشکوک به آلودگی از مزارع چغندرکاری استان گردید و تعداد ۴۸ نمونه از مزارع تربت حیدریه، چناران، نیشابور، فریمان و بجنورد جمع آوری شد. به منظور تشخیص ویروس BNYVV از آزمون داس الایزا (DAS-ELISA) استفاده گردید. از آزمون طعمه گذاری در خاک جهت جداسازی قارچ مورد نظر از خاک استفاده شد. شش هفته بعد ریشه ها از خاک خارج و پس از شستشو با آب در هیدروکسید پتاسیم ۱۰درصد قرار داده شد. سپس قطعاتی از آنها جهت مشاهده فرم پایدار قارچ با میکروسکوپ نوری بررسی شدند. استفاده از میکروسکوپ نوری جهت تعیین پلی میکسا بتا به علت اشکال در رویت فرمهای نابالغ و کوچک و عدم تمایز بین زئوسپورانژیومها و اسپورهای مقاوم سایر قارچها غیر قابل اطمینان و زمان بر است. بنابراین استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلیمراز به عنوان روشی سریع و دقیق مورد استفاده قرار گرفت. برای استخراج آر. ان. ا از غده های نمونه های آلوده از روش رسوب با PEG۶۰۰۰ استفاده شد و بدنبال آن نسخه برداری به طریق وارونه (RT-PCR) جهت ساخت cDNA با استفاده از آغازگر اختصاصی ژنوم قارچ انجام پذیرفت. آزمون پی. سی. آر با استفاده از آغازگرهای اختصاصی رفت و برگشت ژنوم این قارچ بر اساس داده های مونیه و همکاران صورت گرفت. الکتروفورز محصول پی. سی. آر در ژل پلی اکریل آمید ۵ درصد و نیز آگارز ۵/۱ درصد تکثیر قطعه ای به اندازه ۱۷۰ جفت باز را تایید نمود که نشانگر آلودگی نمونه ها به قارچ پلی میکسا بتا بود. با بکار گیری این روش ردیابی قارچ پلی میکسا بتا به طور مستقیم از آر. ان. ا استخراجی امکان پذیر می باشد. واژه های کلیدی: پلی میکسا بتا، ویروس زردی نکروتیک رگبرگ چغندرقند (BNYVV)، آزمون داس الیزا، واکنش زنجیره ای پلیمراز