طراحی، ساخت، و ارزیابی کارایی سازه CRISPR-Cas۹ برای ویرایش ژن EPSPS گوجه فرنگی

در این مطالعه از فناوری ویرایش ژنوم CRISPR-Cas۹ برای ویرایش ژن EPSPS گوجه فرنگی به منظور افزایش مقاومت بهعلف کش گلایفوسیت استفاده شد. sgRNA بر اساس ناحیه ۷۴۸ تا ۷۸۸ ژن EPSPS گوجه فرنگی طراحی شد. بر اساسسیستم کلونینگ گلدن گیت در مرحله اول سازه AtU۶::EPSPS_sgRNA و در مرحله دوم سازه pSlEPSPS-۳۵S::Cas۹-AtU۶::EPSPS_sgRNA ساخته شد. بر اساس تکثیر با PCR و هضم با آنزیم محدود کننده و توالی یابی صحت سازهpSlEPSPS-۳۵S::Cas۹-AtU۶::EPSPS_sgRNA تایید گردید. جهت بیان موقت این سازه در گوجه فرنگی رقم موبیل ازترنسفکشن پروتوپلاست استفاده شد. استخراج پروتوپلاست از لوکول میوه نارس گوجه فرنگی صورت گرفت و سازهpSlEPSPS-۳۵S::Cas۹-AtU۶::EPSPS_sgRNA ترنسفکت شد. همچنین از پروتوپلاستهای ترنسفکت شده DNAاستخراج شد. ناحیه هدف توسط PCR تکثیر و واکنش هضم با آنزیم HincII انجام شد و نتیجه مورد نظر حاصل گردید.