بهینه سازی تخلیص پروتئین نوترکیب خارج غشایی (OMP) باکتری عامل بیماری گرینینگ مرکبات

هدف: پروتئین خارج غشایی omp در سطح خارجی پیکره باکتری عامل بیماری گرینینگ مرکبات (Candidatus Liberibacter asiaticus) وجود دارد. پروتئین مذکور می تواند به عنوان آنتی ژن برای تولید انواع آنتی بادی های مونوکلونال و پلی کلونال مورد استفاده قرار گیرد. با این حال خالص سازی پروتئین های غشایی به دلیل وجود ساختارهای آب گریز با مشکلات فراوانی همراه می باشد. در این راستا، هدف از اجرای پژوهش حاضر، بهینه سازی استحصال و تخلیص پروتئین نوترکیب omp می باشد. مواد و روش ها: از سازه بیانی باکتریایی pET۲۸a حاوی ژن omp برای تولید نوترکیب این پروتئین استفاده شد. بیان ژن  omp در سویه Rosetta باکتری  E. coli صورت پذیرفت. با توجه به آبگریز بودن پروتئین omp، خالص سازی آن در شرایط واسرشته  مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور از غلظت های مختلف سدیم کلراید، اوره و گوانیدین هیدروکلراید در شرایط اسیدی pH  متفاوت استفاده گردید. به منظور دستیابی به پروتئین کاملا خالص نوترکیب، استحصال پروتئین از ژل پلی آکریل آمید با روش های مبتنی بر سونیکاسیون، شستشوی توسط انتشار و الکتروالوشن صورت پذیرفت. بررسی کمیت و کیفیت پروتئین های خالص شده با انجام الکتروفورز SDS-PAGE و محاسبه غلظت پروتئین با نرم افزار ImageJ  انجام گرفت. همچنین برای تایید ماهیت پروتئین خالص شده، آزمون وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی صورت پذیرفت. نتایج: نتایج اولیه نشان داد که استفاده از غلظت ۵۰۰ میلی مولار سدیم کلراید به عنوان یک جزء ضروری در بافرهای استخراج می باشد. همچنین استفاده از اوره به عنوان عامل دناتوره کننده کارایی دو برابری نسبت به گوانیدین هیدروکلراید در میزان پروتئین تخلیص شده داشت و بدین ترتیب بیشترین میزان پروتئین (۴۵۰ میکروگرم در میلی لیتر) زمانی بدست آمد که غلظت ۸ مولار اوره در اجزای بافری تخلیص گنجانده شد. علاوه بر این، نتایج مربوط به جداسازی باند پروتئین از ژل نشان داد که روش الکتروالوشن بهترین کارایی را در بازیابی و جداسازی پروتئین هدف از ماتریکس ژل در مقایسه با روش سونیکاسیون و شستشوی توسط انتشار داشت. نتایج آزمون الکتروفورز پروتئین حاکی از وجود یک پروتئین با اندازه ۳۴ کیلو دالتون متناسب با وزن مولکولی پروتئین omp می باشد. آزمون وسترن بلات نیز موید ماهیت پروتئین نوترکیب در ممبران بود. نتیجه گیری: مطالعه حاضر نشان داد که استفاده از اوره با غلظت ۸ مولار، نمک سدیم کلراید با غلظت ۵۰۰ میلی مولار به همراه تنظیم بافر الوشن روی (۴) pH در مرحله تخلیص پروتئین می تواند به عنوان یک شرایط بهینه برای بدست آوردن بیشترین مقدار پروتئین هدف بکار رود.  همچنین، روش الکتروالوشن به عنوان روش کارآمد جهت استحصال باند پروتئینی از روی ژل آکریل آمید معرفی شد.