طراحی و ساخت سازه های بیانی نوترکیب به منظور تولید و ترشح پروتئین های نوترکیب در ریشه های موئین

هدف: استفاده از سیستم های بیانی گیاهی برای تولید پروتئین های نوترکیب دارای مزایایی از جمله وجود روش های متفاوت تراریختی و کشت، وقوع تغییرات مناسب پس از ترجمه و عدم خطر آلودگی با عوامل بیماری زای حیوانی و میکروبی می باشد. با این حال میزان کم تولید محصول در این سیستم های بیانی، همواره به عنوان چالشی عمده مطرح است. سیستم های بیانی مبتنی بر ترشح در کشت ریشه های موئین، می توانند راه کار مناسبی برای تولید پیوسته مواد موثره بدون نیاز به تخریب بافت گیاهی باشند و به نوبه خود، موجب سهولت فرآیند خالص سازی و کاهش قابل توجه هزینه های مربوط به آن شوند. این پژوهش با هدف طراحی و ساخت سازه هایی با تلفیق همزمان پیشبر اختصاصی ریشه NtREL۱ با سه ترادف نشانه پاتاتین، پکتین متیل استراز و کالرتیکولین برای افزایش بیان اختصاصی پروتئین های نوترکیب در کشت ریشه های موئین و در ادامه ترشح آنها به درون محیط کشت مایع به انجام رسید. مواد و روش ها: توالی نوکلئوتیدی پیشبر اختصاصی ریشه ای NtREL۱ و پپتیدهای نشانه پاتاتین، پکتین متیل استراز و کالرتیکولین از پایگاه داده NCBI دریافت گردید. توالی این پیشبر به منظور شناسایی عناصر تنظیمی Cis دخیل در بیان اختصاصی ریشه ای توسط نرم افزارهای PLACE و PLANT CARE مورد بررسی قرار گرفت. مطالعات بیوانفورماتیکی به منظور طراحی سازه های بیانی pBI۱۲۱ واجد توالی نوکلئوتیدی پیشبر در ترکیب با پپتیدهای نشانه به انجام رسید و جایگاه های برشی مناسب در دو سر قطعات مورد نظر طراحی گردید. پس از دریافت قطعات سنتزی در ناقل pUC۵۷، قطعات با واکنش هضم آنزیمی جداسازی شده و در سازه بیانی pBI۱۲۱ همسانه سازی شدند. نتایج: بررسی پیشبر NtREL۱ نشان داد این پیشبر، غنی از نوکلئوتیدهای AT است. این توالی ها به دلیل سهولت در تبدیل از شکل دو رشته ای به تک رشته ای،  موجب بهبود فرآیند شناسایی توسط سیستم های رونویسی و  افزایش بیان ژن ها می شوند. صحت همسانه سازی پیشبر NtREL۱ در ترکیب با سه پپتید نشانه پاتاتین، پکتین متیل استراز و کالرتیکولین در سازه بیانی pBI۱۲۱ با استفاده از واکنش کلونی پی سی آر، هضم آنزیمی و توالی یابی قطعات همسانه سازی شده در سازه بیانی pBI۱۲۱ با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، تائید شد. نتیجه گیری: از آنجایی که ناقل های بیانی مبتنی بر pBI۱۲۱ نسبت به سایر ناقل های بیانی، کارایی بالایی داشته و به طور گسترده در پروژه های تراریزش ژنتیکی و بیان پروتئین های نوترکیب در گیاهان مورد استفاده قرار می گیرند، ناقل های نوترکیب ساخته شده در این پژوهش می توانند به نحوی موثر برای تولید و ترشح پروتئین های نوترکیب در سیستم های بیانی، مانند کشت ریشه های موئین مورد استفاده قرار گیرند.