پرفیوژن و جداسازی هپاتوسیت از کبد رات

سابقه و هدف: پرفیوژن کبد برای مطالعه متابولیسم ویژه در این ارگان و نیز تهیه هپاتوسیت به کار می رود. برای تهیه هپاتوسیت از کبد رات به طور کلی سه روش مکانیکی، شیمیایی و آنزیمی وجود دارد. هر سه روش دارای مزایا و معایب خاص می باشند. به نظر می رسد تلفیقی از هر سه روش منجر به آسیب کمتر غشا سلول و بازده بیش تر عمل می شود.مواد و روش ها: در این مطالعه کبد در محل خود (in situe) کانوله می شود و بر اساس روش شیمیایی - آنزیمی در سه مرحله پرفیوز می گردد. در اولین مرحله کبد توسط مسیر تک مسیری باز توسط محلول کربس - رینگر فاقد کلسیم و منیزیم و حاوی شلاتور کلسیم (EDTA) به مدت ده دقیقه پرفیوز گردید. در دومین مرحله کبد توسط محلول کربس - رینگر فاقد کلسیم، منیزیم و شلاتور کلسیم برای شستشوی عروق کبد از شلاتور به مدت یک دقیقه دیگر پرفیوز می گردد. در سومین مرحله کبد توسط کربس - رینگر آنزیم کلاژناز (IU/mL ۲۰۰) به مدت نه دقیقه توسط سیستم دو مسیری بسته پرفیوز گردید. سلول های هپاتوسیت در غلظت ۷-۹×۱۰۶ cell/mL در محیط کربس - رینگر (بافر بیکربنات) در فلاسک های شیشه ای مخصوص تحت جو (O۲:CO۲, ۹۵:۵) انکوبه شدند. برای بررسی زنده بودن سلول های هپاتوسیت از تست های منع ورود رنگ (تریپان بلو) و از تست تراوش آنزیم سیتوزولی لاکتات دهیدروژناز (LDH) استفاده گردید.یافته ها: سنجش فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز (LDH) به عنوان نشانگر مهم بخش سیتوزولی در سلول هپاتوسیت و محیط انکوباسیون در آغاز و پایان انکوباسیون نشان داد که در ابتدای انکوباسیون حدود ۹۲ درصد و در پایان انکوباسیون حدود ۸۸ درصد آنزیم در سلول احتباس شده و به ترتیب فقط ۸ درصد و ۱۲ درصد آنزیم از سلول ها به خارج تراوش شده است. بررسی میکروسکوپی سلول های هپاتوسیت نیز نشان دادند که سلول ها دارای غشا صاف، بدون چروکیدگی و پار گی و بدون واکوئل می باشند. هنگام رنگ آمیزی سلول ها با رنگ حیاتی تریپان بلو فقط در ۵ درصد سلول ها رنگ وارد سلول ها گردید.استنتاج: یافته های این تحقیق نشان می دهند که تلفیق روش های مکانیکی، شیمیایی و آنزیمی موجب بهبود کیفیت جداسازی سلول های هپاتوسیت از کبد رات می گردد. به طوری که پرفیوژن کبد توسط شلاتور کلسیم به مدت ۱۰ دقیقه و سپس توسط آنزیم کلاژناز به مدت ۹ دقیقه موجب تولید حدود ۱۰ mL سلول با زنده بودن(Viability) بیش از ۹۰ درصد می گردد.