تولید رده سلولی K۵۶۲ بیان کننده اندونوکلئاز Cas۹ (CRISPR-associated۹)

چکیده سابقه و هدف امروزه ژنوم رده های سلولی به منظور ایجاد مدل های بیماری و درمان آن ها ویرایش می شود. البته بزرگی ژن Cas۹ موجب مشکلاتی از جمله پایین بودن کارآیی سیستم CRISPR شده است. برای حل این مشکل، رده های سلولی بیان کننده Cas۹ تولید شده اند که در آن ها تنها باید بخش RNA راهنمای CRISPR به سلول ترانسفکت شود. مواد و روش ها در این مطالعه تجربی، قطعه PGK-PURO/CMV (PPC) با PCR از وکتور pAAVS۱-puro-DNR  تکثیر شده و در وکتور  pTG۱۹-Tهمسانه سازی شد. سپس قطعه PPC از این وکتور با آنزیم های KpnI و EcoRI خارج شد. وکتور pCas-Guide-AAVS۱ نیز تحت برش آنزیمی مشابه قرار گرفت و اتصال آن با قطعه PPC منجر به ساخت وکتور pPPC-Cas گردید. پس از بهینه کردن شرایط الکتروپوریشن، وکتور pPPC-Cas به درون سلول های K۵۶۲ الکتروپوریت شد و سلول های مقاوم به پرومایسین انتخاب شدند و میزان بیان Cas۹ در آن ها با Real-time PCR بررسی شد. یافته ها با PCR قطعه ای به طول ۲۵۱۴ جفت باز تکثیر شد. وکتورpPPC-Cas  طی دو مرحله همسانه سازی ساخته شد. سلول های ترانسفکت شده مقاوم به پرومایسین انتخاب شدند. انتخاب کلونی در ادامه انجام شد و سه کلونی که نسبت به هم بیان های بالا، متوسط و پایین داشتند، انتخاب شدند. نتیجه گیری در این مطالعه سلول های K۵۶۲ بیان کننده Cas۹ به دست آمدند که از آن ها می توان در مطالعه های آتی ژنومیک عملکردی و نیز تولید مدل های سلولی بیماری های انسانی استفاده کرد.