کلونینگ، بیان ژن و تخلیص آنزیم CEL I اندونوکلئاز از گیاه کرفس

آنزیم CEL I یک مانوزیل گلیکوپروتئین مخصوص گیاهی است که از دسته کرفس استخراج می شود و از جمله اولین آنزیم یوکاریوتی است که پیوند ناجور را با یک اختصاصییت بالا در یکی از دو رشته DNA برش می دهد. هدف از این پژوهش کلون کردن ژن CEL I در محیط آزمایشگاهی است. در این تحقیق از گیاه کرفس، RNA استخراج شد، و Cdna ساخته شد. ژن CEL I اندونوکلئاز با پرایمرهای اختصاصی از طریق (PCR) تکثیر شد و سپس ژن تکثیر شده در T وکتور کلون گردید. پلاسمید نوترکیب به سلول پذیرای سویه TOP10 باکتری اشرشیاکلی انتقال یافت. پلاسمید نوترکیب استخراج و توسط آنزیم های محدود کننده BamHI, SacI هضم گردید. محصول PCR خالص شده، در وکتور بیانی pET32a ساب کلون شد. این وکتور نوترکیب به سلول پذیرای سویه BL21 باکتری اشرشیاکلی انتقال یافت و با تکنیک های کلونی PCR و هضم آنزیمی تأئید گردید. کلونی حاوی وکتور بیانی نوترکیب کشت شبانه داده شد با استفاده از IPTG، پروموتور ژن القا شده و در ساعت های متفاوت نمونه گیری انجام گرفت و روی ژل SDS-PAGE 10% الکتروفورز شد. باندهای پروتئینی ژل بر روی کاغذ نیتروسلولز انتقال داده شد و سترن بلاتینگ انجام گرفت. بالیز روسب های باکتری، نمونه ها از روی ستون کروماتوگرافی تمایلی (His.Tag/S.Tag) عبور داده شد و سپس کروماتوگرام رسم شد در ادامه روی ژل SDS-PAGE 10% الکتروفورز شد. باندهای پروتئینی ژل بر روی کاغذ نیتروسلولز انتقال داده شد وسترن بلاتینگ انجام گرفت. در نهایت آنزیم CEL I در شرایط آزمایشگاهی با موفقیت تولید شد.