مطالعه بیماری نکروز عصبی ویروسی(جداسازی ، شناسایی و بیماری زایی آن) درکفال ماهیان دریای خزر و احتمال انتقال آن به سایر ماهیان

این مطالعه به منظور جداسازی و شناسایی نوداویروس عامل بیماری نکروز عصبی ویروسی‭( VNN ) ‬از ماهیان کفال طلایی‭(liza auratus) ‬دریای خزر صید شده در صیدگاههای استانهای حاشیه جنوب دریای خزر شامل گیلان، مازندران و گلستان و با کمک روشهای کشت سلولی، واکنش زنجیره ای پلیمراز دو مرحله ای ‭(Nested-RT-PCR) ‬، آزمایش پادتن های درخشان‭) (IFAT ‬، ایمونوهیستوشیمی ‭(IHC) ‬، هیستوپاتولوژی، هماتولوژی، باکتریولوژی و میکروسکوپ الکترونی انجام شد. پس از دریافت گزارشهای متعدد مبنی بر بروز تلفات و مشاهده علایم بالینی شامل شنای نامتعارف ( مارپیچی، چرخشی، خوابیده به پشت در سطح آب ) و اتساع محوطه شکمی در ماهیان کفال طلایی صید شده در صیدگاههای سه استان مذکور ضمن مراجعات مکرر به پره های صیادی در طول فصول صید سالهای ‮‭1385‬ تا ‮‭1388‬ تعداد ‮‭428‬ ماهی کفال طلایی در محدوده وزنی ‮‭50‬ تا ‮‭250‬ گرم نمونه برداری گردیدندکه تعدادی در حدود ‮‭312‬ ماهی کفال در استان گیلان و ‮‭116‬ عدد نیز از استانهای گلستان و مازندران صید شدند که اغلب آنها دارای علایم بالینی همچون شنای نامتعادل، تیرگی رنگ بدن و اتساع محوطه شکمی بودند. بافتهای مغز و چشم از ماهیان مورد مطالعه در شرایط استریل جداسازی و جهت انجام آزمایشات کشت سلولی و ‭Nested-RT-PCR ‬در فریزر ‮‭80‬ ‭C ‬نگهداری شدند. به طور همزمان قطعاتی از بافتهای مذکور در فرمالین ‮‭10‬ درصد جهت انجام آزمایشات هیستوپاتولوژی و ایمونوهیستوشیمی و قطعه ای در گلوتارآلدهید 3 درصد برای آزمایش میکروسکوپ الکترونی تثبیت گردیدند.شش روز بعد از تلقیح هموژن فیلتر شده بافتهای مغز و چشم بر روی تک لایه سلولی 1‭-SSN ‬، آثار آسیب سلولی ‭( CPE ) ‬به صورت واکویولاسیون مشاهده شد که در پاساژهای دوم و سوم نیز با شدت بیشتری ایجاد گردید. در مجموع تلقیح هموژن 9 نمونه از ‮‭312‬ ماهی باعث ایجاد ‭CPE ‬گردید. انجام آزمایش ‭Nested- RT-PCR ‬بر روی نمونه های بافتی و سلول های 1‭-SSN ‬آلوده شده‭( CPE ‬مثبت) نتایج مشابهی را به همراه داشت. در آزمایش مستقیم نمونه های بافتی تعداد ‮‭21‬ نمونه مثبت بود وهمچنین تمام نمونه های حاصل از سلولهای 1‭-SSN ‬آلوده‭( CPE ‬مثبت) در آزمایش مزبور مثبت تشخیص داده شدند. در ادامه تشخیص نوع ویروس، آزمایش پادتن های درخشان با استفاده از دو نوع آنتی بادی مونوکلونال مختلف برروی مقاطع بافتی مغز و چشم ماهیان کفال دارای علایم و سلول های آلوده شده 1‭-SSN ‬انجام شدکه ایجاد نقاط درخشان حاکی از وجود آنتی ژن نودا ویروس در نمونه های مورد آزمایش بود و نتایج کشت سلول و ‭Nested- RT- PCR ‬را تایید نمود. در آزمایشات آسیب شناسی بافتی، واکویولاسیون در مقاطع مغز و شبکیه چشم، نخاع و عصب بینایی در اکثر نمونه ها مشاهده گردید و با استفاده از آنتی بادی مونوکلونال ضد نودا ویروس و رنگ آمیزی ‭DAB ‬بر روی مقاطع بافتی در آزمایش ایمونوهیستوشیمی، حضور آنتی ژن های نودا ویروس به صورت نقاط قرمز- قهوه ای مشخص گردید. در آزمایش میکروسکوپ الکترونی با توجه به پراکندگی ویروس در نمونه های بافتی، مقاطع ویروس به صورت دوایری با قطر حدود ‮‭30‬ ‭nm ‬و دارای آرایش منظم تنها در یک نمونه از مقطع چشم ماهی کفال طلایی مشاهده گردید. به منظور تعیین بیماریزایی ویروس جداشده و بررسی امکان انتقال آن از ماهی کفال طلایی به گونه های دیگر، سوپرناتانت سلول 1‭-SSN ‬دارای ‭CPE ‬با ماهیان گوپی ( به صورت حمام) و بچه ماهیان قره برون ( به صورت تزریق در پشت حدقه چشم) مواجهه داده شد که در هر دو مورد علاوه بر بروز علایم بالینی، واکویولاسیون شدید در مغز و شبکیه چشم آنها نیزمشاهده شد. در ادامه مطالعات بیماریزایی، نمونه های ماهی گوپی دارای علایم بالینی با میکروسکوپ الکترونی و آزمایش ایمونوهیستوشیمی مورد بررسی قرار گرفتند و نتایج حاصله نشان داد که حضور نودا ویروس با بروز علایم بالینی، کالبد گشایی و تلفات در ارتباط بوده و می توان بتا نودا ویروس را به عنوان عامل اصلی تلفات ناشی از بروز بیماری نوپدید نکروز عصبی ویروسی ‭(VNN) ‬درکفال ماهیان دریای خزر محسوب نمود. واژه کلیدی: ایران ، دریای خزر، بیماری نکروز عصبی ویروسی، کفال طلایی، تیره سلولی 1‭-SSN ‬، آزمایش پادتن های درخشان، ایمونوهیستوشیمی، ‭Nested-RT-PCR