کریسپر/cas۹؛ جدیدترین تکنولوژی ویرایش ژنی جهان، دقیق وتطبیق پذیربا دست ورزی ژنتیک

تکنیک کریسپر ازبه روز ترین و نوپاترین تکنیک های ویرایش ژنتیکی دنیا بعد ازانتقال ژن تلقی میشود.کریسپر مخففClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats به معنای تناوبهای کوتاه پالیندروم فاصله دار منظم خوشهای است. تا پیش از این مهم، دانشمندان از روش انتقال ژن جهت ویرایش نسخه بیمار ژن استفاده میکردند.(gene transfer) به این صورت که ویروسی بی گزند انتخاب میشد تا نسخهی سالم ژنی را حمل کند که نسخهی معیوب آن در سلول حضورداشت که این کار به نوبهی خود خطرات و ریسک بالایی داشت ازاین نظر که اضافه نمودن یک ژن ناشناس درون یک ویروس تحت عنوان وکتور یا ناقل یا حامل؛ ممکن است منجر به پیدایش بیماری ناشناختهای شود که تاکنون وجود نداشته و یا قرارگیری اشتباه آن میتوانست منجر به سرطان شود. اما درسیستم کریسپرژن ویرایش شده تحت کنترل میباشد واز طریق اضافه نمودن،حذف و یا جایگزینی ژن مد نظر ویرایش صورت میپذیرد.

اولین بار مکانیزم کریسپردر سال 1987توسط یک تیم تحقیقاتی در ژاپن و در باکتری اشریشیا کلای(EColi) بازگو شد به این شکل که در این سیستم یک توالی تکراری به طول29 نوکلئوتید با فاصله 32 نوکلئوتیدی از ژن می تواند باکتریها و آرکی باکتریها را از حمله باکتریوفاژها و پلاسمیدها محافظت کند.در سال 2015کریسپر بطور رسمی به جهان معرفی شد و دنیای ژنتیک را متحول کرد. تکنیکی که توانست ژنوم موجود در هستهی سلول را مستقیما ویرایش کند. در میان دستاوردهای جدیدی که در سالهای اخیردرحوزهی ژن درمانی و درمان سرطان ارائه شده است میتوان این ادعا را داشت که کریسپر از برترین آنهاست. کریسپر/cas9 در40درصد باکتریها و90درصد آرکی باکتریها وجود دارد که در جهت پاسخ به عوامل مهاجمی نظیرویروسها بهکار گرفته میشوند و این چنین فرآیندی همانند سیستم ایمنی ودفاعی برای آنها عمل کرده وسبب القای مقاومت به محتوای ژنتیکی بیگانه مانند آنچه که در پلاسمیدها یا فاژها وجود دارد؛ میشود.اگر بخواهیم خیلی ساده کریسپررا توضیح دهیم به این صورت که؛ قسمتی ازDNAژنومی باکتری توسط پروتئینcas9برش داده میشود و در تهاجم بعدی به باکتری جهت شناسایی وجستجوی عوامل پاتوژن کمک میکند و سرانجام استحالهی DNAویروس را به روش خاصی انجام میدهد. دو دستهی مهم برای کریسپر وجود دارد نوع اول CRISPR casII با نوع 7برای مهندسی ژنوم در سال 2015مطرح شد ودر مرحلهی بعدی از روی ژنهای کمپلکسcas، پروتئینcas ساخته شد و کمپلکس Cas9-crRNA-tracrRNA تشکیل گردید.

مکانیزم ویرایش:

پروتئینهایی در این مکانیزم دخالت دارند که نقش آنها ایجاد فاصله بین ژنهای خاص میباشد و تحت عنوان crispr associated protein نامیده میشوند. جزء اصلی کریسپرو ویرایش ژن شامل آنزیمها و قطعاتDNA هستند. آنزیم ویرایش ژن Cas9 نام دارد، پروتئینی با عملکرد آنزیمی که نقش برش توالی ویژهای ازDNA باکتریایی را برعهده دارد. بنابراین قطعاتی از DNAجدید موردنظر در آن ناحیه قرار میگیرند و یا ممکن است حذف شوند. از نظراین ویژگی برش، میتوان آن را نوکلئاز نامید.آنزیم هایی که در کریسپرنقش دارند علاوه بر cas، cpf1که بسیار اختصاصی است و مشابه casعمل میکند اما از آن کوچکتراست.آنزیم دیگر c2c2 میباشد که بجایDNA، RNAرا مورد هدف قرار میدهد. پس از اتصال صورت گرفته وتشکیل کمپلکس آنزیمcas9 با RNAمصنوعی دست ساز انسان که توالی آن کاملا مشخص است؛ قسمتی از ژنوم توسط cas9بریده میشود در نتیجه ژنومی که از قبل وجود داشت حال از وجود نسخهی معیوب آن عاری میگردد. قطعاتی ازRNAتحت عنوان RNAراهنما یا gRNA(guide RNA) به این شکل کهRNAاز پیش طراحی شده در داخل داربستی از جنس خودش قرار میگیرد(RNA) و این داربستRNA با بخش خاصی ازDNA فقط تشکیل کمپلکس میدهد زیرا که طراحی آن به نحوی صورت گرفته است کهRNAراهنما براحتی میتواند با توالیهای خاصی ازباندهایDNAمیزبان مکمل شود. در ادامه بخش از پیش طراحی شده سبب فراخوانی آنزیمcas9 میشود. نتیجه این میشود که cas9 به راحتی ودقیق مکان صحیح ازDNAرا برش میزند، بدن به این مکانیزم آگاه شده و در جهت ترمیم و اصلاح ایراد ژنتیکی آن برمیآید.

کاربرد:

از این فن آوری برای درمان انواع سرطانها به خصوص ریه؛ استفاده شده است. دراین باره گروه تحقیقاتی از دانشگاه سیچوان به رهبریLu Yo در شهر چنگدو در28اکتبر2016 سلولهای ایمنی فرد مبتلا به سرطان ریه را خارج نمودند و ژن عامل ایجاد پروتئین PD-1 را غیرفعال کردند که این پروتئین عملکرد سلولهای ایمنی را کند میکند. درمان لوکمی؛wangeو همکاران در سال 2014از کریسپرcas9 استفاده کردند.آنها همچنین با مطالعات کتابخانهای شامل 7300sgRNA با ایجاد knock-outبرای غربالگری گسترده ژنومی در لوکمی میلوئید بهره جستند. درمان سرطان پروستات، بیماری ایدز، هپاتیتB ، بهبودکیفیت محصولات کشاورزی و دام همانند گاو،طیور، خوک و...، بهبود در موادغذایی و فرآورده های لبنی همچون ماست ، پنیر و...از طریق باکتریها، قارچها ومخمرها، درمان بیماریهای وراثتی نظیردیستروفی عضلانی دوشن(DMD)، درمان کلسترول بالا و سایر موارد درژنتیک و پزشکی استفاده میشود. کریسپر تاکنون در جانورانی همچون انسان و موش بکارگرفته شده است.

جنیفر دودنا ( پژوهشگر و نویسنده کتاب کد شکن) Jennifer Doudna زاده ۱۹۶۴) زیست شیمی دان اهل آمریکا و استاد دانشگاه کالیفرنیا، برکلی است. او از سال ۱۹۹۷ پژوهشگر موسسه پزشکی هاورد هیوز بوده است. امانوئل شرپانتیه (Emmanuelle Charpentier) . او زاده ۱۱ دسامبر ۱۹۶۸است و در زمینه میکروبیولوژی، ژنتیک و زیست شیمی فعالیت و مطالعه دارد. وی اصالتی فرانسوی ارمنی تبار دارد. این دو دانشمند در سال ۲۰۲۰ بر روی پژوهشی با عنوان «فراهم کردن روشی برای ویرایش ژنوم» یا توسعه ویرایش ژن کریسپر مطالعه میکردند که توانستند نوبل شیمی را از آن خود کنند.

منابع:

1- CRISPRminer is a knowledge base for exploring CRISPR-Cas systems in microbe and phage interactions . Fan Zhang . 31 October 2018-nature

2- Anti-CRISPR: discovery, mechanism and function. Karen L. Maxwell.Alan R. Davidson. April Pawluk. 24 October 2017-nature

3- Ishino Y,. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology. 1987; 169, 5429–5433.

4- Ponnusamy L, Natarajan SR, Manoharan R. MARK2 potentiate aerobic glycolysis-mediated cell growth in breast cancer through regulating mTOR/HIF-1α and p53 pathways. J Cell Biochem. 2022;123(4):759–71.

5- Fischietti M, Eckerdt F, Perez RE, Guillen Magaña JN, Mazewski C, Ho S, et al. SLFN11 Negatively Regulates Noncanonical NFκB Signaling to Promote Glioblastoma Progression. Cancer Res Commun. 2022;2(9):966–78.

6-Wang, J. & Quake, S.R. (2014) RNA-guided endonuclease provides a therapeutic strategy to cure latent herpesviridae infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111, 13157–13162

7- Ishino Y, Shinagawa H. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology. 1987; 169, 5429–5433.

8-Walsh T, Casadei S, Munson KM, Eng M, Mandell JB, Gulsuner S, et al. CRISPR-Cas9/long-read sequencing approach to identify cryptic mutations in BRCA1 and other tumour suppressor genes. J Med Genet. 2021;58(12):850–2.

9- مهندس فرزانه اعوانی –دانشگاه صنعتی امیرکبیر – مهندسی بافت- مجله ی مهندسی پزشکی- شماره 191- اسفند 95 و فروردین 96